本发明专利技术公开了一种用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物及其应用，该LAMP引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3组成。本发明专利技术的LAMP引物组合物用于快速检测样品中的病毒性出血性败血症病毒，对于病毒性出血性败血症病毒具有良好的特异性和灵敏度，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测病毒性出血性败血症病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。
【技术实现步骤摘要】
用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物及其应用。
技术介绍
病毒性出血性败血症(Viral haemorrhagic septicaemia, VHS)是由弹状病毒引起鲑、鳟、狗鱼和大菱鲆等十多种鱼类的一种烈性传染病，能够导致很高的死亡率，其病原体为病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)。病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)属弹状病毒科粒外弹状病毒属，是一种能够感染鲑鳟鱼类的严重传染病，致死率为90%~100%。本病最早发现于欧洲大陆及北美洲，最近几年传到了亚洲地区，并在我国局部地区流行。该病是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疫病，在我国进境动物传染病二类名录中被列为必须申报的疫病。本病主要流行于欧洲 及北美洲，近年来随着水生动物进口贸易的增加，病毒性出血性败血症病毒已传入我国并在一些地区流行，造成了严重的经济损失。目前，国内外对该病病原VHSV的检测方法主要有病毒分离与培养方法、反转录-聚合酶链式反应方法、间接荧光抗体试验方法、酶联免疫吸附试验等，这些检测方法虽已达到准确的诊断，但是耗时长、成本高、仪器设备要求高，检测步骤复杂，不能满足快速、准确检测该病毒的需求。因此，本专利技术尝试探索更为快速、准确、适合现场操作的检测手段，便于对病毒性出血性败血症病毒疫情的监控及预防。逆转录环介导等温扩增技术(Reversetranscription loop-mediatedisothermal amplification,RT-LAMP)是2000年报导的一种新颖核酸扩增技术，该技术的问世解决了核酸诊断上出现的诸多难题，以其高效性、高特异性和反应快速的特点被广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫以及环境中细菌等病原体的检测研究。该技术在目的基因的高保守区域的6个特异性序列设计4条引物，运用具有链置换活性的DNA聚合酶在60~65°C之间的恒温条件下反应几十分钟，就可以完成核酸的扩增反应。该方法具备便捷、灵敏、特异性高，不需要昂贵的仪器，在短时间内便能完成检测等优点，特别适用于中国进出口岸进行快速检验检疫，以便保护水生动物贸易和水产养殖业的可持续性发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于快速、准确检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的LAMP引物组合物。本专利技术的另一目的在于该LAMP引物组合物在检测病毒性出血性败血症病毒中的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案来实现:一种用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物，该引物组合物由序列为SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3组成。本专利技术还提供上述LAMP引物组合物在检测病毒性出血性败血症病毒中的应用，包括以下步骤:(I)提取样品中的RNA ；(2)以步骤⑴中提取的RNA为模板，进行RT-LAMP扩增反应；(3)对步骤(3)得到的RT-LAMP扩增产物进行检测。在上述步骤⑵中，RT-LAMP扩增反应条件为:60_65°C下反应30_90分钟，停止反应；最为优选的反应条件为:62°C下反应60分钟，停止反应。在上述步骤(3)中RT-LAMP扩增产物可以采用如下方法判定样品中是否含有病毒性出血性败血症病毒:①扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，如果在远离点样孔出现梯状条带，则证明所检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒，样品中含有该病毒扩增产物中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化，如果反应后的反应液显示绿色荧光，则证明所检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒，样品中含有该病毒?’③从RT-LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，观察LAMP浊度仪检测图，如果浊度逐渐增加，模块的颜色由绿色逐渐转变为红色，则证明所检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒，样品中含有该病毒。相对于现有技术本专利技术的有益效果在于:本专利技术的LAMP引物组合物，可以快速检测样品中的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，该LAMP引物组合物只对VHSV进行特异性的扩增，与其他病毒并无交叉反应，对VHSV的特异性和灵敏度较常规PCR方法高。利用本专利技术的LAMP引物组合物检测VHSV，检测时间短，对VHSV的特异性和灵敏度高，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测病毒性出血性败血症病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。本专利技术的方法，为我国鱼类能够顺利出口欧盟、美国等国家及地区奠定基础，也为及时发现鱼病疫情隐患，提高疫情预警和防控能力提供理论依据。【附图说明】图1为利用本专利技术LAMP组合物在不同温度下进行的RT-LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1_6依次为反应温度60°C、61°C、62°C、63°C、64°C和65°C时的LAMP扩增结果。图2为利用本专利技术LAMP引物组合物在不同反应时间下进行的RT-LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1_5依次分别为恒温反应30min、45min、60min、75min 和 90min 时的 LAMP 扩增结果。图3为利用本专利技术LAMP引物组合物进行的RT-LAMP扩增反应结果的检测结果，其中图3A是通过琼脂糖凝胶电泳判读的结果:在电泳图中泳道M为DL2000Marker，泳道I和2分别为VHSV样品和阴性对照；图3B是通过检测浊度变化判读的结果:从RT-LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，图3B中横坐标I和2分别为VHSV样品和阴性对照。图4为利用 本专利技术LAMP引物组合物检测VHSV的特异性分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker,泳道1-5依次分别为VHSV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的扩增产物，泳道6为阴性对照。图5为利用本专利技术LAMP引物组合物检测VHSV的灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1_7依次分别为反应体系中VHSV RNA含量10ng、lng、0.lng、0.01ng、lpg、0.lpg、0.01pg 时的扩增产物。【具体实施方式】[0021 ] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买。实施例1本专利技术LAMP弓丨物组合物的设计和合成根据Genbank VHSV基因组中N基因的核苷酸序列(Genbank No:AB672617.1)，使用 Primer Explore V3 和 Primer Premier5.0 软件针对其中的 6 个区域(3，端的 F3c、F2c、Flc以及5’端的B1、B2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物，其特征在于，该LAMP引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3组成。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物，其特征在于，该LAMP弓丨物组合物由序列为SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3组成。2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测病毒性出血性败血症病毒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，肇慧君，胡强，王刚，
申请(专利权)人：吴斌，肇慧君，胡强，王刚，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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