一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法技术

一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，(1)用寡聚组氨酸或类似标签融合表达酶及其突变体，制备诱导表达细胞裂解液为未纯化融合酶样品；(2)固定化抗标签单抗或其它亲和分离介质；(3)所有测定中所用固定化亲和分离介质的结合容量相同；(4)用来自相同未纯化融合酶样品的不同总蛋白量与固定化亲和分离介质反应，分离结合的融合酶测定其活性，获得结合的融合酶活性对反应体系总蛋白量的响应曲线；(5)据亲和反应的化学计量学建立上述响应的数学模型，用单抗为亲和分离介质时所用融合酶远多于固定化单抗结合容量而适用简化模型，用Ni2+-NTA需用非简化模型，预测结合的融合酶最大活性作为比活性的等效量进行比较。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物亲和分析技术，是用于筛选酶变体库时确认阳性突变体及建立酶序列和活性关系的一种快速分析方法，适用于以蛋白或短肽为融合标签表达的酶及其突变体。专利技术的技术背景酶作为催化剂在医药、工业和环境生物
应用广泛且这些应用都需高活性酶。用进化生物技术设计筛选突变体库是获得高活性酶的主要策略，此策略依赖于快速测定大量酶突变体的比活性进行筛选。将酶突变体逐个重组表达、分离纯化后测定比活性是发现高活性突变体最可靠的方法，但其成本和效率使得酶的定向进化的成本和效率很不满意。对于研究酶的序列-活性关系，也是重组表达、分离纯化后测定比活性，其效率和成本也很不满意。用诱导表达酶及其突变体的细胞裂解液直接测定其中的目标酶的活性进行比较是识别催化效率增加的阳性突变体的成本最理想且效率也很高的分析方法。然而，细胞裂解效率和突变体表达效率的波动会带来许多假阳性或假阴性结果，这使得直接用细胞裂解液为样品测定目标酶的活性进行比较和筛选的方法仅仅适合于酶突变体库的初步筛选；经过初步筛选获得的阳性突变体还需要重组表达、分离纯化后再测定比活性确认。测定细胞裂解液中融合酶及其突变体的活性对总蛋白浓度的比值，即表观比活性，仅能消除细胞裂解效率的影响，不能消除诱导表达效率的影响，也很难提高识别阳性突变体的可靠性。本专利技术建立一种以重组表达酶及其突变体细胞裂解液为样品，有效消除细胞裂解效率差异、酶及其突变体诱导表达效率差异的方法，快速比较混合物样品中目标酶的比活性。为纯化重组表达蛋白，其常与6个组氨酸^His)标签肽或类似短肽、分子量较小的蛋白为融合标签进行重组表达；此类标签可添加在重组表达酶及其突变体的N端或C端；针对此类融合标签的单抗或多抗、Ni2+-NTA类金属离子螯合物，是此类融合标签的亲和分离介质。研究酶的序列-活性关系、筛选酶突变体库时，重组表达的酶及其突变体的融合标签可保持不变。本专利技术利用此融合标签和固定化亲和分离介质的亲和反应和直接测定亲和分离的融合酶的活性，优化固定化亲和分离介质结合容量及亲和反应体系的样品量，建立了一种快速预测固定化亲和分离介质的最大亲和分离结合活性作为融合酶比活性等效量的方法，用于快速比较细胞裂解液中未纯化融合酶及其突变体的比活性。
技术实现思路
概述本专利技术涉及如下技术要点:(I)将融合酶及其突变体诱导表达后制备细胞裂解液作为未纯化融合酶样品，同时制备不含插入序列的空载体诱导表达的细胞裂解液为对照裂解液用于稀释样品，(2)将识别所选融合标签的抗体或类似亲和分离介质固定在微孔板测定室的内孔表面或易于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面，(3)分离亲和反应结合的融合酶及其突变体并测定结合融合酶及其突变体的活性，(4)用相同量亲和分离介质,测定结合融合酶及其突变体的活性对亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或总活性的响应曲线，(5)据可逆结合化学计量学分析响应曲线预测亲和分离介质结合位点被饱和结合后的最大活性，(6)所预测的结合位点被饱和结合后的融合酶及其突变体的最大活性是其比活性的等效量；用已知比活性的融合酶或某个突变体测定固定化亲和分离介质的结合容量后，用此等效量可换算出融合酶及其突变体的比活性。本专利技术的主要内容和实施细节的特征如下:1、，其特征如下:(一 )、在拟比较比活性的酶及其突变体的N端或C端，按分子克隆及重组表达常规过程经连接肽段加入选定的融合标签，构建原核或真核融合表达载体，用相应诱导剂或诱导条件诱导表达，收集诱导表达宿主细胞，按下所述制备未纯化融合酶样品:(I)选择对融合酶及其突变体没有抑制作用的弱碱性Tris-HCl、中性磷酸盐或其它缓冲液为裂解缓冲液；耐超声的融合酶及其突变体，超声处理细胞后再离心得细胞裂解液；不耐超声的融合酶及其突变体，用上述裂解缓冲液加溶菌酶处理细胞再离心得细胞裂解液；耐受表面活性剂的融合酶及其突变体，用含Tween-20或NP-40类表面活性剂的裂解缓冲液处理细胞再离心得细胞裂解液；上述细胞裂解液为未纯化融合酶样品；(2)用不含插入序列空载体转化相同宿主细胞后相同条件下诱导表达；来自制备未纯化融合酶样品时相同体积培养液的细胞诱导表达后，用制备未纯化融合酶样品时80%体积裂解缓冲液，相同方法所制备裂解液为不含融合酶及其突变体的对照裂解液；( 二)、选择并固定化一种针对所选用融合标签的亲和分离介质:(I)所选亲和分离介质需以适当方式固定化在固相支持介质表面并保留对融合酶及其突变体中融合标签的亲和力，以实现对融合酶及其突变体的亲和分离；(2)针对超过连续6个氨基酸残基融合标签，其高亲和力单抗及多抗适合作为此类融合标签的亲和分离介质；此类抗体能通过吸附固定化在微孔板的孔内表面，或共价固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；(3)当用4个及以上连续组氨酸构成的组氨酸标签时，Ni2+-NTA类金属离子螯合物适合作为组氨酸标签融合酶及其突变体的亲和分离介质；此类亲和分离介质需经对吸附固定在微孔板孔内表面的载体蛋白如牛血清白蛋白共价键修饰而被间接固定化在微孔板的孔内表面，或通过共价反应而固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；(4)在微孔板的孔内表面经吸附固定化抗体或间接固定化螯合金属离子所需载体蛋白时，50.0mM且pH为9.6碳酸钠是适合的固定缓冲液；用96孔板时，每孔加含0.1到2.0 μ g所需单抗或足量载体蛋白的200 μ L缓冲液且每孔所用蛋白总量/体积相同；固定抗体时设不加抗体仅用固定缓冲液处理的对照孔；每孔用360yL牛血清白蛋白或类似物溶解在20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl缓冲液封闭测定室内表面的暴露部分；(5) Ni2+-NTA类螯合物通过其所含氨基与微纳米颗粒表面活化的羧基反应而共价固定化，或转变成异硫氰酸酯形式修饰微孔板上吸附固定化载体蛋白的氨基而固定化；固定化此类亲和分离介质的简单方案为先固定化螯合基团再螯合金属离子；(三)、用相同量的固定化亲和分离介质，测定亲和分离所得融合酶或其突变体的活性对亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶总活性的响应曲线:(I)融合标签与固定化亲和分离介质的反应称亲和反应，其所用缓冲液称为亲和反应缓冲液；制备未纯化融合酶样品时所用不含表面活性剂的裂解缓冲液、PH7.2?9.0的Tris-HCl缓冲液、中性或碱性磷酸盐缓冲液，以及其它对融合酶及其突变体没有抑制作用且适合亲和反应的缓冲液，都适合作为本专利技术所述亲和反应缓冲液；(2)用微孔板吸附固定化抗体或间接固定化亲和分离介质时，每孔所含亲和分离介质结合容量相同；用微纳米颗粒固定亲和分离介质时，每次测试所用微纳米颗粒量相同；(3)亲和反应体系中，来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体，同固定化亲和分离介质亲和反应时间为10?120分钟，反应温度在20?37摄氏度；亲和反应达到平衡后，用亲和反应缓冲液反复洗涤除去非特异吸附部分；再加入PH接近最适且含必须辅助因子的缓冲液溶解的显色底物，启动固定化亲和分离介质所结合融合酶的反应；(4)用微孔板固定化亲和分离介质时，用酶标仪连续跟踪反应过程测定吸收变化，或反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再用酶标仪测定吸收；(5)用便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒固定化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，其特征如下：(一)、在拟比较比活性的酶及其突变体的N端或C端，按分子克隆及重组表达常规过程经连接肽段加入选定的融合标签，构建原核或真核融合表达载体，用相应诱导剂或诱导条件诱导表达，收集诱导表达宿主细胞，按下所述制备未纯化融合酶样品：(1)选择对融合酶及其突变体没有抑制作用的弱碱性Tris‑HCl、中性磷酸盐或其它缓冲液为裂解缓冲液；耐超声的融合酶及其突变体，超声处理细胞后再离心得细胞裂解液；不耐超声的融合酶及其突变体，用上述裂解缓冲液加溶菌酶处理细胞再离心得细胞裂解液；耐受表面活性剂的融合酶及其突变体，用含Tween‑20或NP‑40类表面活性剂的裂解缓冲液处理细胞再离心得细胞裂解液；上述细胞裂解液为未纯化融合酶样品；(2)不含插入序列空载体转化相同宿主细胞后在相同条件下诱导表达；来自与制备未纯化融合酶样品时相同体积培养液的细胞诱导表达后，用制备未纯化融合酶样品时80％体积裂解缓冲液，相同方法所制备裂解液为不含融合酶及其突变体的对照裂解液；(二)、选择并固定化一种针对所选用融合标签的亲和分离介质：(1)所选亲和分离介质需以适当方式固定化在固相支持介质表面并保留对融合酶及其突变体中融合标签的亲和力，以实现对融合酶及其突变体的亲和分离；(2)针对超过连续6个氨基酸残基融合标签，其高亲和力单抗及多抗适合作为此类融合标签的亲和分离介质；此类抗体能通过吸附固定化在微孔板的孔内表面，或共价固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；(3)当用4个及以上连续组氨酸构成的组氨酸标签时，Ni2+‑NTA类金属离子螯合物适合作为组氨酸标签融合酶及其突变体的亲和分离介质；此类亲和分离介质需经对吸附固定在微孔板孔内表面的载体蛋白如牛血清白蛋白共价键修饰而被间接固定化在微孔板的孔内表面，或通过共价反应而固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；(4)在微孔板的孔内表面经吸附固定化抗体或间接固定化螯合金属离子所需载体蛋白时，50.0mM且pH为9.6碳酸钠是适合的固定缓冲液；用96孔板时，每孔加含0.1到2.0μg所需单抗或足量载体蛋白的200μL缓冲液且每孔所用蛋白总量/体积相同；固定抗体时设不加抗体仅用固定缓冲液处理的对照孔；每孔用360μL牛血清白蛋白或类似物溶解在20.0mM且pH为7.4的Tris‑HCl缓冲液封闭测定室内表面的暴露部分；(5)Ni2+‑NTA类螯合物通过其所含氨基与微纳米颗粒表面活化的羧基反应而共价固定化，或转变成异硫氰酸酯形式修饰微孔板上吸附固定化载体蛋白的氨基而固定化；固定化此类亲和分离介质的简单方案为先固定化螯合基团再螯合金属离子；(三)、用相同量的固定化亲和分离介质，测定亲和分离所得融合酶或其突变体的活性对亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶总活性的响应曲线：(1)融合标签与固定化亲和分离介质的反应称亲和反应，其所用缓冲液称为亲和反应缓冲液；制备未纯化融合酶样品时所用不含表面活性剂的裂解缓冲液、pH7.2～9.0的Tris‑HCl缓冲液、中性或碱性磷酸盐缓冲液，以及其它对融合酶及其突变体没有抑制作用且适合亲和反应的缓冲液，都适合作为本专利技术所述亲和反应缓冲液；(2)用微孔板吸附固定化抗体或间接固定化亲和分离介质时，每孔所含亲和分离介质结合容量相同；用微纳米颗粒固定亲和分离介质时，每次测试所用微纳米颗粒量相同；(3)亲和反应体系中，来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体，同固定化亲和分离介质亲和反应时间为10～120分钟，反应温度在20～37摄氏度；亲和反应达到平衡后，用亲和反应缓冲液反复洗涤除去非特异吸附部分；再加入pH接近最适且含必须辅助因子的缓冲液溶解的显色底物，启动固定化亲和分离介质所结合融合酶的反应；(4)用微孔板固定化亲和分离介质时，用酶标仪连续跟踪反应过程测定吸收变化，或反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再用酶标仪测定吸收；(5)用便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒固定化亲和分离介质时，有两种方式终止融合酶反应再测定吸收：反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再除去微纳米颗粒、用酶标仪或光度计测定吸收，或反应指定时间后快速分离去除微纳米颗粒、用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应、用酶标仪或光度计测定吸收；(6)改变亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性测定亲和分离融合酶或其突变体活性即初速度；结合的融合酶或其突变体活性随亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶或其突变体总活性变化称响应曲线；(7)用固定化抗体为亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品如下稀释：将对照裂解液总蛋白浓度稀释到与未纯化融合酶样品相同再用于梯度稀释未纯化融合酶样品，最后用亲和反应缓冲液稀释相同体...

【技术特征摘要】
1.一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，其特征如下: (一)、在拟比较比活性的酶及其突变体的N端或C端，按分子克隆及重组表达常规过程经连接肽段加入选定的融合标签，构建原核或真核融合表达载体，用相应诱导剂或诱导条件诱导表达，收集诱导表达宿主细胞，按下所述制备未纯化融合酶样品: (1)选择对融合酶及其突变体没有抑制作用的弱碱性Tris-HCl、中性磷酸盐或其它缓冲液为裂解缓冲液；耐超声的融合酶及其突变体，超声处理细胞后再离心得细胞裂解液；不耐超声的融合酶及其突变体，用上述裂解缓冲液加溶菌酶处理细胞再离心得细胞裂解液；耐受表面活性剂的融合酶及其突变体，用含Tween-20或NP-40类表面活性剂的裂解缓冲液处理细胞再离心得细胞裂解液；上述细胞裂解液为未纯化融合酶样品； (2)不含插入序列空载体转化相同宿主细胞后在相同条件下诱导表达；来自与制备未纯化融合酶样品时相同体积培养液的细胞诱导表达后，用制备未纯化融合酶样品时80%体积裂解缓冲液，相同方法所制备裂解液为不含融合酶及其突变体的对照裂解液； (二)、选择并固定化一种针对所选用融合标签的亲和分离介质: (1)所选亲和分离介质需以适当方式固定化在固相支持介质表面并保留对融合酶及其突变体中融合标签的亲和力，以实现对融合酶及其突变体的亲和分离； (2)针对超过连续6个氨基酸残基融合标签，其高亲和力单抗及多抗适合作为此类融合标签的亲和分离介质；此类抗体能通过吸附固定化在微孔板的孔内表面，或共价固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面； (3)当用4个及以上连续组氨酸构成的组氨酸标签时，Ni2+-NTA类金属离子螯合物适合作为组氨酸标签融合酶及其突变体的亲和分离介质；此类亲和分离介质需经对吸附固定在微孔板孔内表面的载体蛋白如牛血清白蛋白共价键修饰而被间接固定化在微孔板的孔内表面，或通过共价反应而固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面； (4)在微孔板的孔内表面经吸附固定化抗体或间接固定化螯合金属离子所需载体蛋白时，50.0mM且pH为9.6碳酸钠是适合的固定缓冲液；用96孔板时，每孔加含0.1到2.0 μ g所需单抗或足量载体蛋白的200 μ L缓冲液且每孔所用蛋白总量/体积相同；固定抗体时设不加抗体仅用固定缓冲液处理的对照孔；每孔用360 μ L牛血清白蛋白或类似物溶解在.20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl缓冲液封闭测定室内表面的暴露部分； (5)Ni2+-NTA类螯合物通过其所含氨基与微纳米颗粒表面活化的羧基反应而共价固定化，或转变成异硫氰酸酯形式修饰微孔板上吸附固定化载体蛋白的氨基而固定化；固定化此类亲和分离介质的简单方案为先固定化螯合基团再螯合金属离子； (三)、用相同量的固定化亲和分离介质，测定亲和分离所得融合酶或其突变体的活性对亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶总活性的响应曲线: (1)融合标签与固定化亲和分离介质的反应称亲和反应，其所用缓冲液称为亲和反应缓冲液；制备未纯化融合酶样品时所用不含表面活性剂的裂解缓冲液、PH7.2~9.0的Tris-HCl缓冲液、中性或碱性磷酸盐缓冲液，以及其它对融合酶及其突变体没有抑制作用且适合亲和反应的缓冲液，都适合作为本发明所述亲和反应缓冲液； (2)用微孔板吸附固定化抗体或间接固定化亲和分离介质时，每孔所含亲和分离介质结合容量相同；用微纳米颗粒固定亲和分离介质时，每次测试所用微纳米颗粒量相同； (3)亲和反应体系中，来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体，同固定化亲和分离介质亲和反应时间为10~120分钟，反应温度在20~37摄氏度；亲和反应达到平衡后，用亲和反应缓冲液反复洗涤除去非特异吸附部分；再加入PH接近最适且含必须辅助因子的缓冲液溶解的显色底物，启动固定化亲和分离介质所结合融合酶的反应； (4)用微孔板固定化亲和分离介质时，用酶标仪连续跟踪反应过程测定吸收变化，或反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再用酶标仪测定吸收； (5)用便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒固定化亲和分离介质时，有两种方式终止融合酶反应再测定吸收:反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再除去微纳米颗粒、用酶标仪或光度计测定吸收，或反应指定时间后快速分离去除微纳米颗粒、用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应、用酶标仪或光度计测定吸收； (6)改变亲和反应体系中来自未纯化融 合酶样品总蛋白量或融合酶总活性测定亲和分离融合酶或其突变体活性即初速度；结合的融合酶或其突变体活性随亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶或其突变体总活性变化称响应曲线； (7)用固定化抗体为亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品如下稀释:将对照裂解液总蛋白浓度稀释到与未纯化融合酶样品相同再用于梯度稀释未纯化融合酶样品，最后用亲和反应缓冲液稀释相同体积；每次测试所用蛋白总量相同而来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体总活性不同，且每次测试所用来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量大于固定化抗体最大结合容量的10倍； (8)用Ni2+-NTA类亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品直接用亲和反应缓冲液进行梯度稀释；稀释后亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量和其中融合酶或其突变体的总活性都不同；来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量，不超过固定化亲和分离介质最大结合容量的3倍； (9)据拟比较比活性的融合酶及其突变体的比活性范围，优化每次/孔测试所用固定化亲和分离介质的量，使得当来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体占据固定化亲和分离介质结合位点总量50%时，亲和反应后分离所得融合酶或其突变体在设定测定条件下作用于其显色底物造成的产物或底物吸收变化速度超过每分钟0.003 ； (10)固定所用固定化亲和分离介质用量调节来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性的范围；所用样品总蛋白量的最大量应使固定化抗体结合位点被占据比例最大值不小于50%，固定化Ni2+-NTA类亲和分离介质结合位点被占据比例最大值不小于80% ;所用样品总蛋白量的最小量应使得结合酶反应的吸收变化高于每分钟0.003 ； (11)用微孔板固定化单抗为亲和分离介质时，用20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl或类似中性缓冲液为洗涤缓冲液，重复洗涤微孔除去非特异结合成分；洗涤时先用含0.01~0.05% Tween-20类表面活性剂的洗涤缓冲液洗涤至少I次，再用不含此类表面活性剂的洗涤缓冲液重复洗涤至少3次；最后一次洗涤后将洗涤缓冲液尽量完全去掉；用磁性或非磁性微纳米材料固定化亲和分离介质时，直接用亲和反应缓冲液反应洗涤； (12)将显色底物溶解在测定活性的缓冲液中，在20到37摄氏度间某温度预热10分钟以上；在恒温条件下，每孔或每次测试加入相同体积的显色底物溶液；当用微孔板固定化亲和分离介质时，所加入的显色底物溶液的体积，需小于吸附固定亲和分离所用抗体或载体蛋白时所用溶液的体积；将微孔板快速震荡1.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，杨晓兰，胡小蕾，李元丽，陈春艳，刘霖，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85