本发明专利技术公开了一种快速批量靶向化筛选优势目标微藻的方法及系统：该方法系统包括从典型工业位点采集含有藻类的样品；样品的限制性富集培养；富集培养后藻株的固体平板稀释点布克隆；藻落克隆子细胞脂滴的原位染色；染色后待筛选藻株油脂含量的比较分析；优势藻株的平板转移。该发明专利技术实现了目标藻株快速、高效批量靶向化筛选，利用该发明专利技术获得的微藻具有高浓度二氧化碳固定耦合生物柴油原材料生产的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法及系统
本专利技术涉及生物质能源
，具体涉及一种快速批量靶向化筛选可用于转化工业烟道气二氧化碳为三酰基甘油酯的微藻藻株的方法及系统。
技术介绍
能源危机以及化石燃料燃烧带来的温室效应日益严峻，直接影响一个国家国际形象，制约者一个国家经济的可持续发展。因此，在全球共同面对全球变暖、推进经济社会可持续发展的形势下，可再生清洁能源的开发及CO2减排已成为世界各国政府关注的焦点。在众多的可再生能源(风能、地热能、水能、太阳能、生物质能等)中，生物柴油以其在能量密度、燃烧性等方面与石化柴油具有极高相似性，甚至超过石化柴油，且具有易降解、基本不含硫及芳烃类化合物、碳中性对环境友好等特性，受到世界各国的广泛关注。一些发达国家于20世纪90年代初便开始了生物柴油的商业化生产。目前商业化生产的生物柴油主要是第一代和第二代生物柴油制备技术。第一代生物柴油制备技术主要是利用油料作物为原料制备生物柴油。第二代生物柴油制备技术主要是利用废弃油脂以及麻风树等为原料制备生物柴油。我国生物柴油产业兴起较晚，目前，我国生产生物柴油的原料主要是大豆、油菜等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实及废餐饮油等。但是，这种以传统农业为基础的生物柴油生产方式，不仅产量低、成本高，而且不符合“不与农业争粮争地”的根本原贝U，另外不能满足生物柴油产业对原料持续增长的需求。研究发现许多藻类可以快速生长并在体内产生大量的油脂，被称为产油微藻。产油微藻即在一定条件下，将CO2、碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为微藻细胞内大量贮存的油脂，且油脂含量超过生物总量20%的微型藻类。微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量高、可以与废水废气的处理相互耦合等优点而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油制备原料。据不完全统计，目前，国内外从事微藻生物柴油研究及开发的主要机构超过100家，其中有5家正在开展半工业化中试实验(例如美国的Green FueL,我国河北新奥等)，从2007年到2009年底，投入微藻生物能源开发的资金总量超过70亿美元。但是现阶段没有大规模商业化生产微藻生物柴油的报道。近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划，973基础规划，以及国家十二五发展规划的重点项目之一。各高校和科研院所都开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石柴油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前的市场需求；二是目前藻种自养培养密度低，导致下游加工处理工艺成本过高。而将“微藻生物柴油生产”与“co2减排”高度耦合技术，不仅可以降低微藻生物柴油生产成本，实现温室气体的减排并且可获得其它高附加值产品来创造额外的生态及社会经济效益。这种新理念为缓解当前能源紧缺和温室效应的形势提供了新途径，也为微藻生物柴油的生产提供了一种可行性方案。事实上，deMorays and Costa (2007a), Yoo (2010),唐大海(2011)，Fernandez (2012)等人的研究结果表明某些微藻藻种可以用于二氧化碳减排以及生物柴油原材料的生产。但是，藻类种群结构丰富多样，并不是所有的藻类都能够满足生产的需求，因此如何快速高效的从大量样品中获得符合要求的目标藻株是该项技术工业化应用的关键环节之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种目标微藻藻株高效、快速、易于操作的靶向筛选工具，利用该专利技术获得的藻株油脂含量高并且可以耦连高浓度CO2的高效固定，为微藻碳减排及生物柴油生产的商业化应用以及基础理论研究提供优良藻种。本专利技术首先公开了一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，包括以下步骤:I)采集含有藻类的酸性废水水样；2)对步骤I)采集到的废水水样进行富集培养，获得富集水样；富集培养的条件为:温度10~40°C，光照强度2500~200001UX，光照时间为8~24h/天，通气量0.1~lvvm，其中CO2体积分数为0.03~50%，富集培养时间为8~20天；3)对步骤2)的富集水样进行梯度稀释，并将稀释后的富集水样点到BGll固体培养基平板上，进行平板培养；平板培养的条件为:10~40°c，光照强度2500~200001UX，光照时间为8~24h/天，平板培养时间为8~15天；4)步骤3)的平板培养结束后，挑取固体培养基平板上长出的单个微藻藻落于载玻片上制备微藻细胞的临时装片，采用苏丹黑B亲脂性染料进行染色，在光学显微镜下观察，与含油参照微藻藻株进行比较，选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞，即为目标微藻。优选的，步骤I)所述酸性废水水样的pH值为3.0~6.5。步骤I)所述酸性废水水样采集自燃煤发电厂、水泥厂或冶炼厂工业烟道气附近水域。优选的，步骤2)所述富集培养的条件为:温度25~35°C，光照强度6000~90001ux，光照时间为9~18h/天，通气量0.2~lvvm，其中CO2体积分数为10~20%，富集培养时间为10~15天。更优的，步骤2)所述富集培养的条件为:温度为28°C，光照强度75001UX ;光照时间为12h/天，通气量为0.33vvm，其中CO2体积分数为15%，富集培养时间为14天。优选的，步骤3)所述梯度稀释为采用灭菌后的BGll液体培养基将富集水样稀释IO1 ~IO7 倍。优选的，步骤3)中所述富集水样点到固体培养基平板上时，每次点样量为I~50微升稀释的富集水样。优选的，步骤3)中所述BGll固体培养基中琼脂含量为0.8~1.5wt%。 步骤4)中所述微藻细胞临时装片的制备方法可参考《微生物学实验》周德庆中微生物细胞临时装片的制备方法。优选的，步骤4)所述苏丹黑B亲脂性染料中，溶质为0.6wt%的苏丹黑B，溶剂为95v/v%乙醇水溶液，染色温度为100°C。优选的,步骤4)中所述含油参照微藻藻株为Chlorella pyrenoidosa SJTU-2。步骤4)所述选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞是指:选择细胞中黑色油 滴总面积占该细胞总面积的百分比，较参照株细胞中黑色油滴总面积占参照株细胞总面积的百分比更大的微藻细胞。所述目标微藻为细胞内油脂含量高于20wt%，且耐受0.03~15%体积分数二氧化碳浓度的微藻藻株。更优选的，还可以对前述方法筛选出的目标微藻进行更进一步的筛选，方法为:采用氯仿甲醇法分别检测前述方法筛选出的目标微藻和参照株细胞中油脂含量，选择油脂含量显著高于参照株细胞中油脂含量的目标微藻，即为高含脂量微藻。本专利技术第二方面公开了前述方法在生物质能源领域的应用。优选的，为前述方法在生物柴油生产领域的应用。采用本专利技术快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，本专利技术筛选获得四株可以生产生物柴油的微藻，分离的四株藻株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号分别为 CCTCC M2013607、CCTCC M2013608、CCTCC M2013609、C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，包括以下步骤：1）采集含有藻类的酸性废水水样；2）对步骤1）采集到的废水水样进行富集培养，获得富集水样；富集培养的条件为：温度10～40℃，光照强度2500～20000lux，光照时间为8～24h/天，通气量0.1～1vvm，其中CO2体积分数为0.03～50%，富集培养时间为8～20天；3）对步骤2）的富集水样进行梯度稀释，并将稀释后的富集水样点到BG11固体培养基平板上，进行平板培养；平板培养的条件为：10～40℃，光照强度2500～20000lux，光照时间为8～24h/天，平板培养时间为8～15天；4）步骤3）的平板培养结束后，挑取固体培养基平板上长出的单个微藻藻落于载玻片上制备微藻细胞的临时装片，采用苏丹黑B亲脂性染料进行染色，在光学显微镜下观察，与含油参照微藻藻株进行比较，选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞，即为目标微藻。
【技术特征摘要】
1.一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，包括以下步骤: 1)采集含有藻类的酸性废水水样； 2)对步骤I)采集到的废水水样进行富集培养，获得富集水样；富集培养的条件为--温度10~40°C，光照强度2500~200001UX，光照时间为8~24h/天，通气量0.1~lvvm，其中CO2体积分数为0.03~50%，富集培养时间为8~20天； 3)对步骤2)的富集水样进行梯度稀释，并将稀释后的富集水样点到BGll固体培养基平板上，进行平板培养；平板培养的条件为:10~40°C，光照强度2500~200001uX，光照时间为8~24h/天，平板培养时间为8~15天； 4)步骤3)的平板培养结束后，挑取固体培养基平板上长出的单个微藻藻落于载玻片上制备微藻细胞的临时装片，采用苏丹黑B亲脂性染料进行染色，在光学显微镜下观察，与含油参照微藻藻株进行比较，选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞，即为目标微藻。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述酸性废水水样的PH值为3.0~6.5o3.如权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪晓玲，巩三强，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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