本发明专利技术提供一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒。是从质粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切获得目的基因hTERT，插入pSG218穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带hTERT基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pPE3-F11B共转染至人胚肾293细胞，得到携带hTERT的非增殖型腺病毒。用该重组腺病毒感染人类多发性骨髓瘤细胞，可以使细胞过度表达hTERT基因，增强细胞对表阿霉素的耐药。本发明专利技术的主要用途是建立过表达hTERT基因的多发性骨髓瘤细胞株模型，并在此模型上进一步研究hTERT基因参与多发性骨髓瘤细胞耐药的机制。
【技术实现步骤摘要】
表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种表达hTERT基因的重组腺病毒及其应用。
技术介绍
端粒(telomere)是真核生物染色体末端的特殊帽状结构，随着每次染色体的分裂而缩短，当其长度达到临界状态是即诱发细胞衰老与死亡。人类端粒酶(telomerase)的主要作用是以自身RNA亚基(TERC)为模板，利用其逆转录酶亚基(hTERT)逆转录合成端粒重复序列(TTAGGG)并添加于染色体末端，从而维持端粒长度的稳定。hTERT是端粒酶活性的主要限速酶，在绝大多数的恶性肿瘤细胞中被激活，使细胞获得永生化能力；此外，hTERT的激活还能通过多种途径调节肿瘤细胞的增殖与凋亡，增强细胞对化疗药物、氧化损伤以及电离辐射的抵抗性。研究端粒酶功能的手段之一是通过构建合适的载体导入外源性hTERT基因，导致hTERT在细胞内过度表达。端粒酶在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等人类淋巴系统恶性肿瘤中同样被激活。这类恶性疾病目前面临的主要问题是无法彻底治愈。目前，hTERT基因表达变化对细胞内信号通路与基因表达的影响，并不明确。调节hTERT基因的表达可能有助于找到治疗上述疾病的新途径；而且hTERT作为肿瘤通用抗原，本身也是理想的肿瘤治疗靶点。构建高效的负载hTERT基因的载体是进行上述研究的重要前提。腺病毒表达载体具有一系列独特的优点:1.与人类基因同源，因而目的蛋白的表达水平高，功能完全；2.腺病毒基因不会与宿主染色体基因整合，因而不会影响宿主结构基因的正常表达，也不会导致插入性突变，从而使目的基因准确表达；3.可以插入较大的外源基因片段(8.5kB) ;4.感染效率高，对增殖细胞与非增殖细胞均有感染力；4.腺病毒基因组进入细胞核的效率高达40% ;5.安全性好，对人的致病力与致突变力低。由于腺病毒载体在人类细胞上进行基因转移与蛋白表达的高效性，因此成为当今使用最多的病毒载体之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，先用内切酶 EcoR I 从质粒 pIRES2-EGFP-hTERT 中酶切获得目的基因 hTERT(SEQ ID N0.l,4015bp),插入质粒PSG218 (3926bp)中巨细胞病毒启动子的下游的EcoR I (1008)酶切位点，得到携带hTERT基因的重组腺病毒质粒pDC318-hTERT(7941bp)，再将该重组腺病毒载体与病毒骨架载体PPE3-F11B用脂质体介导法共转染至人胚肾293细胞(HEK细胞)进行包装，得到携带hTERT的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，hTERT基因插入pSG218穿梭载体后，转化的细菌为E.coli DH5 α，随后在该细菌内重组、扩增。所述携带hTERT基因的腺病毒表达载体命名为pDC318_hTERT。本专利技术的另一个目的是提供所述一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒在hTERT基因过表达研究中的应用。该重组腺病毒感染靶细胞后可以使靶细胞过度表达hTERT基因，可用于进一步研究hTERT基因介导肿瘤细胞耐药及其机制的研究。本专利技术公开的携带hTERT基因的重组非增殖型腺病毒VDC318_hTERT，可高效感染人类多发性骨髓瘤细胞株，并在细胞内过度表达hTERT基因。本专利技术的主要用途是建立了过表达hTERT基因的多发性骨髓瘤细胞株模型，并在此模型上进一步研究hTERT基因参与多发性骨髓瘤细胞耐药的机制。实验证明，受本专利技术的携带hTERT基因的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT体外感染的人类多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226，可分别在基因水平和蛋白水平检测到hTERT的表达上调；并且，上调hTERT基因表达后，RPM1-8226细胞对表阿霉素的抗药性显著增强。所述受本专利技术的重组腺病毒VDC318-hTERT感染的过表达hTERT的RPM1-8226骨髓瘤细胞模型也属于本专利技术的保护范围。【附图说明】图1为pDC318-hTERT载体酶切鉴定电泳图；将hTERT基因插入pSG218穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带hTERT基因的重组穿梭载体的酶切鉴定结果。图中Ml 为 ADNA/EcoRI+Hindlll marker, M2 为 lOObpDNALadder，泳道 I 为 BamH I 单酶切获得1519bp + 6422bp 片段，泳道 2 为 Kpn I + Sac I 酶切获得 1431bp + 2465bp + 4045bp 片段，泳道 3 为 Pvu II 单酶切获得 330bp + 441bp + 526bp + IlOObp + 1515bp + 4029bp片段，泳道 4 为 Pst I 单酶切获得 30bp + 185bp + 496bp + 825bp + 1260bp + 5145bp 片段。图2为通过PCR扩增11型Fiber鉴定重组腺病毒VDC318-hTERT的结果；PCR产物长度731bp。其 中M为IOObp DNA Ladder ；N为阴性对照；P为阳性对照(上述已构建的pDC318-hTERT质粒)；1_3分别为包装好的1_3号病毒样本，目标条带731bp。图3为通过PCR扩增hTERT鉴定重组腺病毒VDC318_hTERT的结果；PCR产物长度1085bp。其中M为IOObp DNA Ladder ;N为阴性对照；P为阳性对照(上述已构建的pDC318-hTERT质粒)；1_3分别为包装好的1_3号病毒样本；目标条带1085bp。图4为不同MOI值的重组腺病毒VDC318-hTERT对多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226活力的影响。用MOI值为0，2，10,50的VDC318-hTERT腺病毒数转染RPM1-8226细胞24及48小时后用MTT法检测细胞活力。图5A为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的RT-PCR鉴定结果。转染后扩增hTERT基因，产物长度304bp。图5B为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的RT-PCR鉴定结果。转染后扩增hTERT基因，产物长度196bp。图6为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的Western Blot鉴定结果。图7为MTT法检测重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞对表阿霉素抗药性增强的鉴定结果。其中A.用不同浓度的表阿霉素处理24小时后，8226-hTERT细胞株的细胞活力显著高于对照细胞株用不同浓度的表阿霉素处理48小时后，8226-hTERT细胞株的细胞活力显著高于对照细胞株；C.8226-hTERT细胞株对表阿霉素的24小时IC50值较对照细胞提高55.06% ；48小时IC50值较对照细胞提高59.31%。【具体实施方式】本专利技术结合附图和具体实施例作进一步的详细说明。下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可参见《MolecularCloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell, David ff.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，其特征在于，通过以下步骤获得：先用内切酶EcoR I从质粒pIRES2‑EGFP‑hTERT中酶切获得SEQ ID NO.1的目的基因hTERT，插入质粒pSG218中巨细胞病毒启动子的下游的EcoR I酶切位点，得到携带hTERT基因的重组腺病毒质粒pDC318‑hTERT，再将该重组腺病毒载体与病毒骨架载体pPE3‑F11B用脂质体介导法共转染至人胚肾293细胞，得到携带hTERT的重组非增殖型腺病毒VDC318‑hTERT，其中hTERT基因插入pSG218后，转化的细菌为E. coli DH5α，随后在该细菌内重组、扩增。
【技术特征摘要】
1.一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，其特征在于，通过以下步骤获得:先用内切酶EcoR I从质粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切获得SEQ ID N0.1的目的基因hTERT，插入质粒PSG218中巨细胞病毒启动子的下游的EcoR I酶切位点，得到携带hTERT基因的重组腺病毒质粒pDC318-hTERT，再将该重组腺病毒载体与病毒骨架载体PPE3_F11B用脂质体介导法共转染至人胚肾293细胞，得到携带hTERT的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，其中hTERT基因插入pSG...
【专利技术属性】
技术研发人员：张越峰，金洁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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