本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用，该方法包括以下步骤：设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；使用上述特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。本发明专利技术提供的新的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，操作简单、且准确性高。
【技术实现步骤摘要】
—种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用。
技术介绍
维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)是介导活性维生素D— 1，25 (OH) 2D发挥生物效应的生物大分子，位于细胞膜或细胞核中。1，25 (OH)2D激素信号分子在靶细胞与VDR结合形成激素-受体复合物，该复合物作用于靶基因上的特定DNA序列，对结构基因的表达产生调节作用。因此，1，25 (OH) 2D在维持机体钙-磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面的重要作用是通过VDR介导实现的。VDR基因上存在众多单核苷酸多态性位点(Single NucleotidePolymorphisms, SNPs),它们广泛分布于基因启动子、外显子和内含子等区域。这其中的一些SNPs可能通过各种机制影响VDR基因表达或蛋白质活性水平，从而影响到机体健康状况。Rsl 1568820[美国生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的SNPs编号]是位于VDR基因启动子上的一个SNP，并处于尾型同源盒转录因子_2 (Caudal Type Homeobox Transcription Factor2, CDX-2,为一种小肠特异性同源盒转录因子)与VDR启动子结合的区域，故通常也叫Cdx-2位点。该位点多数情况下的等位基因为G，少数情况下为A。 VDR上Cdx-2位点的A等位基因可促进⑶X_2调节VDR启动子的活性而提高VDR基因转录，促进小肠钙吸收。AA基因型能降低骨质疏松、骨质疏松性骨折、原发性侏儒症的发病风险，而系统分析发现该位点AA基因型与肿瘤风险增加有关。因此，检测Cdx-2位点的基因型，对研究VDR相关的生物医学作用具有重要价值。在众多分析SNP的实验技术中，聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)后的限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)分析(PCR-RFLP)通常是最为简单、有效的技术。但在目前知道的全部限制性内切酶中，仅有Bst4CI (或其同切口限制性内切酶HpyCH4II1、Tsp4C1、TaaI)能够识别VDR基因Cdx-2位点所在的核苷酸序列(ACN'GT)，这类内切酶较不常用，且缺乏PCR扩增该目的片段的理想引物。同时，也尚未见到通过引物碱基替换引入其它酶切位点而实现分析的报道。因此，此前的研究者通过测序、探针杂交或高分辨率熔解曲线法(HighResolution Melting, HRM)分析等方法来检测该位点的基因型。1.测序法。该技术是分析核苷酸(或碱基)种类及排列顺序的直观方法，需要PCR仪和测序仪等。通过PCR反应扩增含有VDR基因Cdx-2位点的核酸片段，再用测序仪判读该片段中依次排列的全部核苷酸种类，从测序报告中直接判定该DNA片段中Cdx-2位点的等位基因喊基。因测序原理的不同，可有不同的测序设备可选。如Illumina、AB1、LifeTechnology.Roche等等公司均有自己的品牌测序仪。这些测序设备通常含配套检测试剂，如ABI3100/3700系列的核酸序列检测仪，可结合ABI PRISM SNaPShot Multiplex试剂盒使用。测序设备价格相对较贵，大都在100万元以上，配套试剂也较为封闭。这类方法大致分析流程是:特异性引物扩增含SNPs目的片段的PCR反应一PCR产物纯化一纯化产物为模版的再次PCR扩增(如用特殊试剂盒ABI SNaPshot)—纯化PCR产物一测序一软件分析。2.探针技术法。主要是使用TaqMan探针，针对含有Cdx-2位点的VDR基因片段设计一对特异性引物，同时，设计两种分别带有不同荧光染料的特异性探针。TaqMan探针是在探针5'-端标记荧光染料，3'-端标记荧光淬灭剂，抑制同一条探针5'-端荧光染料的荧光信号；但当探针断裂或分解后，位于探针两端的荧光基团和猝灭基团分离，前者发出的荧光信号可被检测，从而反映出某反应体系中是否具有能与该探针特异性结合的目的基因片段。这一方法的实现，需在实时荧光定量PCR仪上设定运行特定的温控反应程序。在目的DNA片段变性-退火阶段，完全匹配的探针会特异性地结合到互补的Cdx-2等位基因片段上；扩增目的片段的阶段，特异性结合的探针会被复制延伸DNA模版的聚合酶从5'-端外切下来，发生探针分解、断裂，通过检测该探针所带的特定荧光信号，判断探针所对应的某一基因型。同理，如果另一荧光染料被检测到，说明待测DNA片段是该荧光探针所对应的另一基因型。3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)。该方法依赖于高精度PCR仪(如LightScanner> Roche480II等设备)和饱和染料(如LC Green)。目的基因片段在含特异性引物等PCR反应体系中经过变性-退火-延伸反应后，饱和染料插入到扩增的目的DNA双链中后，发出特定波长的荧光信号；而在熔解反应阶段，双链DNA会解开成为单链并释放出饱和染料，荧光信号出现降低和消失的过程。荧光信号在整个过程中的强弱变化过程被仪器检测记录，生成熔解曲线。由于目的DNA片段不同基因型中的GC含量以及碱基互补性存在差异，该熔解曲线的峰值温度和峰形会有所差异，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，即能分辨Cdx-2的C/G基因型。测序、探针杂 交或高分辨率溶解曲线分析等方法均依赖于昂贵的仪器和试剂，以及较高的实验操作技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用，旨在解决由于针对VDR的Cdx-2多态性位点扩增设计引物难度极大、导致无法通过常规的PCR-RFLP的方式，简单、准确地进行VDR基因多态性位点Cdx_2分析的问题。本专利技术是这样实现的，一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，包括以下步骤:设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；使用上述特异性PCR弓丨物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。以及，一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法在肥胖流行病学研究领域中的应用。本专利技术提供的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，通过在用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物近3’端人为突变一个碱基，从而使得该突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点，使得BseMII内切酶能选择性的对扩增产物的酶切位点进行酶切反应，从而达到分析所述VDR基因多态性位点Cdx-2的基因型的目的。该方法不仅操作简单便捷、成本低廉，且准确度高。【附图说明】图1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析VDR基因多态性位点Cdx‑2的方法，包括以下步骤：设计用于扩增VDR基因Cdx‑2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx‑2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；使用上述特异性PCR引物扩增Cdx‑2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。
【技术特征摘要】
1.一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，包括以下步骤: 设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点； 使用上述特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物； 使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物； 对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。2.如权利要求1所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，所述特异性PCR引物的上游引物用Cdx-2F表示，下游引物用Cdx-2B表示，所述Cdx-2F、Cdx_2B的序列分别如SED ID NO: 1、SED ID N0:2所示，具体为:Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；Cdx-2B:GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG, 其中Cdx-2F近3’端第三个碱基T为突变碱基。3.如权利要求1所述的分析VDR基因多态...
【专利技术属性】
技术研发人员：周继昌，朱玉梅，刘小立，杨应周，杨慧，郭平，徐健，车晓玲，
申请(专利权)人：深圳市慢性病防治中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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