酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酿酒酵母基因缺失菌株的应用，属于环境治理技术领域。其提供的三个基因的缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐或其它培养器里，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的环境工程应用奠定基础。这种筛选过程规模大，效率高，筛选出的菌株切实提高了重金属镉的吸收能力。

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用
本专利技术涉及一种酿酒酵母基因缺失菌株的应用，属于环境治理
。
技术介绍
镉是一种有毒的重金属环境污染物。空气中的镉主要来自家庭或工业产生的废气、汽车尾气、金属加工行业、电池或油漆制造业以及废物的处理过程。镉可以从污染源地随着空气传播，污染食物或水质。烟叶本身可以积累较高浓度的镉，因而吸烟是镉污染的重要来源之一。近来的流行病学案例研究进一步证实镉具备致癌性。肺癌、前列腺癌、胰腺癌和肾癌的发生都与长期接触镉有关。随着我国工业的发展，近年来发生了多次大面积的镉污染事件，包括2005年的广东北江镉污染，2009年的湖南浏阳镉污染，2011年的云南曲靖镉污染和2012年的广西龙江镉污染事件。这给我国环境造成了极大的压力。酿酒酵母(Saccharomyces cere visiae)是重要的发酵工业微生物，且被认定为GRAS (Generally Regarded as Safe)生物，因此被广泛研究用于重金属生物吸附材料。通过功能基因组学手段，我们筛选到酿酒酵母基因组中与镉离子耐受性相关的基因，阐明参与镉主动吸收和代谢的途径及其调控机理，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的酵母工程菌株奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酿酒酵母缺失菌株，在清除环境水质中镉方面的应用，还公开了一种大规 模高效筛选耐受镉基因的方法，并得到了三个对镉离子敏感而且对镉离子吸收能力显著增加的基因缺失菌株，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的酵母工程菌株奠定基础。按照本专利技术提供的技术方案，酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，三株酿酒酵母基因缺失菌株，应用于去除环境水质中的重金属。所述重金属为重金属镉。所述三株酿酒酵母基因缺失菌株分别缺失#招2、CYS3和CYS4三个基因；其中MIDI基因缺失菌株，其分类命名为Saccharomyces cereFisae,对应缺失的基因序列如SEQID N0.1所示,CU基因缺失菌株,其分类命名为cererisae,对应缺失的基因序列如SEQ ID N0.2所不基因缺失菌株,其分类命名为cerevisae,对应缺失的基因序列如SEQ ID N0.3所示。从美国Invitrogen Inc公司购买同源的以BY4743为母菌株的4600个单基因缺失菌株出发，进行筛选:在添加IOOmM镉的YPD固体培养基上对菌株进行培养24-48小时，发見midl、cys3、cys4三株菌株对镉敏感。进而对它们吸收镉能力进行测定，发现这三株菌株对铺的吸收能力提闻。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的三个缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐里，用于水质中镉的高效吸收和去除镉离子的环境工程。这种筛选过程规模大，效率高，筛选结果切实获得了镉的吸收能力增加的菌株。【附图说明】图1实施例2中各基因缺失菌株和野生型酿酒酵母菌株细胞内镉离子含量测定图。A:野生型菌株BY4743、i/ii/#、汉和#招7基因缺失菌株；B:野生型菌株BY4743、和基因缺失菌株。【具体实施方式】实施例1菌株的筛选 a、初步筛选。用已灭菌的384针接菌器将酿酒酵母缺失株文库(从美国InvitrogenInc公司购买)中的菌株影印到YPD+100 mM CdCl2的培养基上，同时在YB)培养基上影印一次(作为对照)。平板在 30°C生化培养箱中培养2-3天后，拍照记录结果。通过与YPD培养基上菌株的生长结果对比，找出YPD+100 mM CdCl2培养基上有生长缺陷的菌株，既为镉离子敏感候选菌株。YPD培养基:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。b、通过倍比稀释(梯度稀释)方法对镉离子敏感候选菌株进行验证。从酿酒酵母缺失株文库中挑取镉离子敏感候选菌株，在YPD平板上活化后，接种到YPD液体培养基中过夜培养。将菌株过夜培养物用无菌水按10倍依次稀释至10的-4次方，然后从每个稀释浓度中取3mL分别点在YPD+100mM CdCl2和YPD平板上，30°C培养2天后观察生长情况，拍照，记录实验结果。与YPD平板上菌株的生长情况相比，确定对100 mM CdCl2敏感的基因缺失菌株。最终，从酿酒酵母缺失株文库中共发现106个基因缺失菌株对镉离子敏感，其中包括#招7、CYS3和CYS4三个基因的缺失菌株。实施例2原子吸收法测定酿酒酵母缺失株胞内镉离子浓度 a、活化菌株。在YPD平板上活化菌株{MID1、CYS3和CYS4\b、挑取单菌落(2mm直径的菌落一个)接于YPD液体培养基中过夜培养24h，基本达到饱和。C、将过夜培养物分别转接到新的50 mL液体YPD+CdCl2 (50 μ Μ)液体培养基中，使初始OD吸光度值达到0.2，30°C培养4h。d、样品处理: (I)将步骤c的最终培养物2000g离心2 min。(2)用冰上预冷的10 mM MgCl2溶液(含IM sorbitol山梨糖醇)洗细胞三次，用重悬和离心的方法。(3)洗好的细胞重悬于5 mL 10 mM MgCl2溶液中(不含sorbitol)。(4)取0.3mL步骤(3)所得的细胞重悬液加入步骤(2)所得的2.7 mL IOmM的MgCl2溶液中，混匀后测OD 660nm吸光度值；10 mM MgCl2溶液做空白对照。(5)加入浓 H2SO4 (10M)至终浓度 0.5% (50 mM)，95°C水浴放置 IOmin。(6)离心，取上清，用原子吸收光谱法测定相应金属离子浓度。经原子吸收法检测，结果表明MID1、CYS3和67货基因的缺失菌株吸收镉的能力和野生型酿酒酵母菌株相比分别提高了 11倍、9倍和7倍以上，而其它两个对照基因缺失菌株菌株,来自以上从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母缺失株文库)没有区别，如图1 所示。Y坐标为各个菌株细胞胞内镉离子含量。BY4743为野生型菌株对照，cys3和cys4为镉吸收能力和野生型菌株没有显著差异的两株基因缺失菌株。本文档来自技高网...

【技术保护点】
酿酒酵母基因的缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，其特征是：三株酿酒酵母基因缺失菌株，经培养后应用于去除环境水质中的重金属。

【技术特征摘要】
1.酿酒酵母基因的缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，其特征是:三株酿酒酵母基因缺失菌株，经培养后应用于去除环境水质中的重金属。2.如权利要求1所述酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，其特征是:所述重金属为重金属镉。3.如权利要求1所述酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋伶活，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32