探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测制造技术

相互作用并标记的多核苷酸探针和反义探针和/或互补的靶探针，为我们提供了用于扩增或检测核酸的组合物及方法。这些组分的竞争性热力相互作用导致显示靶频率的信号变化，并且可以提供促成单碱基识别错误的检查功能。这些探针、反探针组合物能进行实时荧光定量PCR检测，终点检测和微生物的微阵列检测，耐药突变和癌症相关的变异。一些探针、反义探针在两个引物之间作为内部探针，一些作为引物探针。采用两个探针：反义探针系统检测同一模板的不同方面，以辨别或量化一些靶序列。还提供了增强靶扩增和检测特定单碱基变异的系统。探针也可通过引入一个碱基不匹配以增加相差一个碱基的正确与不正确的靶的热力学识别力而修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用的相关申请本申请要求于2011年9月15日提交的第61/534,925号、名称为“探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测”的美国临时专利申请的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。序列表本专利技术包括其全部内容通过引用并入本文的一个序列表。
本专利技术涉及核酸探针
和特异性的鉴定以及定量DNA或RNA序列的组合物和方法。本专利技术特别涉及基因扩增期间或扩增后靶向基因的标记和检测。
技术介绍
靶向多核苷酸序列的检测通常是基于使得标记DNA探针与感兴趣的靶序列杂交的方法。为了有效地工作，该探针-靶杂交产物必须杂交后进行洗涤以除去未结合的探针和被弱结合到非特异性靶的探针。然而，在实时PCR(美国专利4,965,188；美国专利5,210,015；美国专利5,487,972；美国专利5,538,848)的条件下，洗涤步骤是不可行的，因此，必须设计出当它们被结合到匹配的靶上时选择性地生成信号或者当它们未被结合并在溶液中自由漂浮时已减弱或淬火信号的新的探针。为了达到这个目的，一直依赖于使用一个供体和受体分子间的荧光能量激发和转移的探针，如两个荧光团之间或荧光团和淬灭剂([Didenko V，(2001)Biotechniques31：1106-1116，1118，1120-1121；Chen et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA30：94：10756-10762)。供体的荧光发射光谱应该与受体的吸收或激发光谱重叠。当它们很靠近(10至100埃)时，所述荧光供体分子的激发态能量然后被转移到受体分子上。然而，如果受体分子是荧光信号本身有荧光性的，它提供了一个较长波长的发射信号。如果受体分子是一种有效的淬灭剂，荧光信号会明显地减少，而且可以基本上关闭。TAQMAN.RTM和分子信标探针都属于这种实时PCR检测的常用探针。在这两种情况下，它们是作为内部探针，其用于与一对感兴趣的靶区域侧翼的相对的引物相结合。引物扩增靶片段，探针选择性地结合到引物位点之间的识别序列，由此导致相对于靶频率增加的荧光信号的增加。虽然这些检测系统实际上是相似的，但它们采用不同的检测机制。一种TAQMAN.RTM探针包含与靶序列互补的约20至30个碱基的合成寡核苷酸，并且在相对的两端将其标记上荧光供体和受体(美国专利5,538,848)。通常地，5′端具有更短波长的荧光团，例如荧光素，和3′端标记有更长波长的发射荧光团(如TAMRA.RTM)或非荧光淬灭剂如Black Hole Quencher.RTM。内部淬灭剂也被使用。而TAQMAN：RTM专利已经过期，这项技术仍然是用于实时PCR的主要探针系统。分子信标探针也可以使用荧光相互作用来检测和量化PCR产物，每个探针通常具有5′荧光标记端和3′淬灭剂标记端(美国专利5,925,517；Tyagi et al.，(1996)Nat.Biotechnology14：303-308)。然而，分子信标探针进一步包括约5至7个互补的碱基的小片段，并在溶液中结合在一起，形成茎-环结构，其中所述淬灭剂和荧光团标记端都被放在一起，且信号被抑制。SCORPlON.RTM探针还提供一种与分子信标相似的茎-环检测机制，除了该探针还具有一个作为扩增引物(Whitcombe et al.，(1999)Nat.Biotechnol.17：804-807；US Pat.6,326,145)的附加片段之外。这些探针使得茎-环结构保持在荧光团淬火的未杂交状态。当变性再次发生接着退火时，所述探针片段结合到模板中，从而打开了茎-环结构并释放荧光。类似SCORPlON.RTM，SUNRISE.RTM探针包含在扩增期间连接到被延伸的发夹探针的引物。这使得内部淬灭剂标记与5′末端的荧光团分离(Nazarenko et al.，(1997)Nucl.Acids Res.25：2516-2521)。传统的双标记探针需要选择性的设计和高昂的成本。它们的合成是困难的，而且需要手工合成后添加至少一种标记，以及高压液相色谱纯化。TAQMAN.RTM和分子信标探针还需要探针侧翼的两个相对的引物。要在退火步骤中有效地发挥作用，TAQMAN.RTM和分子信标探针必须更长，并具有高于引物5到10℃的Tm(解链温度)，因为该探针在延伸之前必须牢牢结合到靶上。这种要求使得很难设计或开发可以选择性地检测SNPs(单核苷酸多态性)或单碱基突变的双标记探针，因此，假阳性是一个常见的问题。FISH(荧光原位杂交)技术要求四个处理步骤：1)标记探针的制备方法，2)探针杂交以固定变性靶，3)未结合的探针的洗涤，和4)荧光激发和检测(Barch M.J，，编辑“ACT细胞遗传学实验指南”第二版，纽约：Raven出版社；1991)。小心的洗涤步骤是有效检测的关键因素，因为信噪比高度依赖于洗涤的严格性。过度洗涤可大大降低信号。基因芯片检测与FISH检测类似。阵列通常根据与寡核苷酸cDNA探针结合的印刷玻璃或硅基板；应用一定是被杂交到探针的荧光标记的DNA或RNA靶；严格地洗涤阵列；然后检测结合的靶，通常是通过激光扫描(Schena et al.，(1995)Science270：467-470；Heller et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94：2150-2155)。像FISH探针，其洗涤步骤同样复杂和费时。然而，靶的制备和标记是昂贵的，因为每个靶样是唯一的，限制了其在常规的基于微阵列中的测定，特别是在临床诊断中的用途。专利技术概述本专利技术包括一种适合于DNA或RNA序列的实时和终点检测的探针系统，尤其是可以区分单碱基变异如SNP和点突变的探针。本专利技术特别是涉及提供适合于定量PCR(实时PCR)的探针，其中小的基因片段被指数扩增和定量检测。本专利技术提供了在结构上和功能上相关的一系列探针系统，但在特异性或敏感性的相应等级方面有偏差，并且其可以被组合在一起以提供新的诊断或量化功能。本专利技术的一个主要方面是一种包含有能够一起反应的两个标记的寡核苷酸、一个探针和一个反义探针的探针：反义探针系统。该探针序列与预定的靶序列是互补的，并且该反义探针序列与该探针是互补的，除了在非末端位置包含的至少一个不匹配碱基以外。该反义探针被设计用于提供该探针的一种错误检测机制。在一些实施例中，该探针通常标记有荧光发射器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性地检测靶核苷酸序列的系统，所述系统包括至少一种探针：反义探针系统，其包括：(a)包括与第一靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的探针寡核苷酸，以及与其连接的第一标记部分；和(b)包括除了在非末端位置至少一个不匹配的碱基外与所述探针寡核苷酸完全互补的核苷酸序列的反义探针寡核苷酸，和第二标记部分，其中，所述第二标记部分连接到所述反义探针寡核苷酸或者是所述反义探针寡核苷酸的区域，其中：(i)该探针寡核苷酸被配置为对第一靶核苷酸序列的杂交亲和力高于对所述反义探针寡核苷酸的杂交亲和力；所述反义探针寡核苷酸被配置为对所述探针寡核苷酸的杂交亲和力高于对感兴趣的第二靶核苷酸序列的杂交亲和力；(ii)在第一靶核苷酸序列存在时，所述探针寡核苷酸和所述第一靶核苷酸序列形成双链，由此所述第一和第二标记部分不发生相互作用，从而提供了第一可检测信号；(iii)在所述第一靶核苷酸序列不存在时，该探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸形成双链，从而允许所述第一和第二标记部分发生相互作用以提供经调制的可检测信号，其中所述第一可检测信号和所述经调制的可检测信号是可区分的；及(iv)在与所述第一靶序列相差至少一个碱基不匹配的第二靶核苷酸序列存在时，探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸优先形成双链，由此抑制所述探针寡核苷酸与第二靶核苷酸序列形成双链。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.15 US 61/534,9251.一种选择性地检测靶核苷酸序列的系统，所述系统包括至少一种
探针：反义探针系统，其包括：
(a)包括与第一靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的探针寡核苷酸，以
及与其连接的第一标记部分；和
(b)包括除了在非末端位置至少一个不匹配的碱基外与所述探针寡核
苷酸完全互补的核苷酸序列的反义探针寡核苷酸，和第二标记部分，其
中，所述第二标记部分连接到所述反义探针寡核苷酸或者是所述反义探
针寡核苷酸的区域，其中：
(i)该探针寡核苷酸被配置为对第一靶核苷酸序列的杂交亲和力高于
对所述反义探针寡核苷酸的杂交亲和力；所述反义探针寡核苷酸被配置
为对所述探针寡核苷酸的杂交亲和力高于对感兴趣的第二靶核苷酸序列
的杂交亲和力；
(ii)在第一靶核苷酸序列存在时，所述探针寡核苷酸和所述第一靶核
苷酸序列形成双链，由此所述第一和第二标记部分不发生相互作用，从
而提供了第一可检测信号；
(iii)在所述第一靶核苷酸序列不存在时，该探针寡核苷酸和反义探针
寡核苷酸形成双链，从而允许所述第一和第二标记部分发生相互作用以
提供经调制的可检测信号，其中所述第一可检测信号和所述经调制的可
检测信号是可区分的；及
(iv)在与所述第一靶序列相差至少一个碱基不匹配的第二靶核苷酸序
列存在时，探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸优先形成双链，由此抑制
所述探针寡核苷酸与第二靶核苷酸序列形成双链。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述探针寡核苷酸和第一靶核苷
酸序列的双链，以及所述探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸的双链，相
差至少约2千卡/摩尔的ΔG和至少约4℃的Tm；并且其中所述探针寡核
苷酸和第二靶核苷酸序列的双链，以及所述探针寡核苷酸和第一靶核苷
酸序列的双链，相差至少约4千卡/摩尔的ΔG和至少约8℃的Tm。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述探针寡核苷酸序列配置有不

\t匹配的碱基位置，该位置离所述第二靶核苷酸序列与所述探针序列之间
预期的不匹配约两个碱基；由此，所述两个不匹配碱基产生探针寡核苷
酸：第二靶核苷酸序列双链的内部两个或三个碱基的未杂交区域，所述双
链从而具有的ΔG和Tm小于探针寡核苷酸：反义探针寡核苷酸双链的ΔG
和Tm。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述探针寡核苷酸连接到固体基
底。
5.如权利要求1所述的系统，其中一个标记部分是荧光发射器，并
且另一个标记部分包含荧光调制器；其中所述荧光调制器选自由以下组成
的组：淬灭剂化合物、荧光化合物、金属颗粒以及富含鸟嘌呤的缀合
物。
6.如权利要求1所述的系统，其中所述探针寡核苷酸包含荧光发射
器并且包含荧光调制器或第二荧光发射器，并且其中所述反义探针寡核
苷酸包含荧光调制器并且任选地包含荧光发射器或第二荧光调制器。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述探针寡核苷酸和所述反义探
针寡核苷酸中的至少一个包含以下各项中的至少一个：非天然核苷酸、
小沟结合物(MGB)，以及Zip核酸(ZNA)。
8.如权利要求1所述的内部探针：反义探针系统，其中所述系统是
iDDS探针，其中所述探针寡核苷酸和任选地反义探针寡核苷酸的3′端被
阻断，以防止聚合酶延伸；并且其中所述系统还包括为扩增包含第一靶
核苷酸序列的核酸区域而配置的一对侧翼引物。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述系统是Flip探针，其中所述
反义探针寡核苷酸进一步在其3′端包括第一引物寡核苷酸和所述系统还
包括第二引物寡核苷酸，其中所述第一和第二引物寡核苷酸被配置用于
扩增包括所述第一靶核苷酸序列的核酸区域。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述反义探针寡核苷酸和第一引
物寡核苷酸通过无碱基间隔子区相连。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述系统是包含引物-探针扩增
子检测系统的ZIPR探针，其中所述探针寡核苷酸包括引物序列并且被配
置成与引物寡核苷酸配合以扩增靶核苷酸序列，由此，当所述探针寡核

\t苷酸被引入到扩增子中时，生成可检测信号。
12.如权利要求11所述的系统，进一步包含第二探针寡核苷酸，其
中所述第一和第二探针寡核苷酸选择性地与核酸模板的不同靶核苷酸序
列杂交；并且其中所述两个探针寡核苷酸各具有与其连接的标记部分，并
且其中所述标记部分提供了两种不同的可检测信号或提供相同的可检测
信号。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述第一探针寡核苷酸包含引
物-探针，所述引物-探针被配置为与引物寡核苷酸配合以扩增具有第一标
记的第一扩增子，从而提供与扩增子频率相关的信号，并且其中，所述
第二探针寡核苷酸是第二引物-探针或内部探针，其包含第二标记和与靶
序列互补的序列；其中所述靶序列包含所述第一扩增子的可变序列段或
在核酸模板别处的可变序列；由此第一引物-探针和所述第二探针之间的
信号传递差异提供相对于所述第一扩增子频率的所述变体序列频率的指
示。
14.如权利要求13所述的系统，其中至少一个探针系统选自由ZIPR
引物-探针、内部iDDS探针或内部Flip探针组成的组。
15.如权利要求11所述的系统，其中所述引物-探针系统备选地包含
G-Force引物-探针，所述G-Force引物-探针包括：(i)5’荧光标记的探
针片段，其包括约7-9个碱基的富含胞嘧啶的序列，(ii)无碱基的间隔
子，(iii)与所述富含胞嘧啶的序列区互补的富含鸟嘌呤的反义探针序列，
以及(iv)引物序列；由此，当被标记的引物-探针寡核苷酸被引入到所产生
的扩增子中时，能够产生可检测的信号。
16.如权利要求11所述的系统，所述系统还包括适于扩增和检测
RNA或DNA靶序列的ISAM等温扩增系统，其中所述引物-探针寡核苷

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·A·谢弗，
申请(专利权)人：戴维·A·谢弗，
类型：发明
国别省市：美国;US