截短的HIV包膜蛋白(ENV)、其相关方法和组合物技术

本发明专利技术提供了关于新HIV包膜蛋白的方法和相关组合物。在某些实施方案中，本发明专利技术涉及用于制备、生产和施用分离的新HIV包膜核酸和蛋白质序列(其适于，例如，作为HIV疫苗)的方法及组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】联邦资金 本专利技术部分由政府支持，合作协议号码为W81XWH-07-2-0067。联邦政府在本专利技术中享有相应权利。 相关申请的交叉引用 本申请要求2011年4月25日提交的美国临时专利申请系列号61/478,857的优先权权益，其通过引用并入本文。 专利
本专利技术大体上涉及新的HIV包膜蛋白和其相关方法及组合物。更具体地，本专利技术涉及涉及用于制备、生产和施用分离的新HIV包膜核酸和蛋白质序列(其适于，例如在某些实施方案中，作为HIV疫苗)的方法及组合物。 专利技术背景 AIDS或获得性免疫缺陷综合征，由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起，具有以下几种临床特征，包括：消耗综合征、中枢神经系统退化和导致机会致病菌感染和恶性肿瘤的深度免疫抑制(profound immunosuppression)。HIV是动物反转录病毒慢病毒(lentivirus)属的成员，该属包括羊的羊髓鞘脱落病毒和牛、猫科及猴免疫缺陷病毒。迄今，人们已鉴定出两种紧密相关的HIV(HIV)类型，称为HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是AIDS最常见的致病原因。然而，HIV-2尽管在基因组结构和抗原性上不同，却导致相似的临床症状。 在全球流行的占主要地位的HIV-1的形式被称为HIV-1的主要组。一共有三种HIV-1组，主要组(M组)、异常组(outlier group，O组)和非M/非O组(N组)。还有P组。M组进一步被分为九种不同的遗传亚型，这些亚型通常称作进化枝(clade)和循环重组体型(CRF)。HIV-1的M组 的亚型/进化枝标记为A、B、C、D、F、G、H、J和K。B进化枝在美国最为普遍，而C进化枝在世界范围内最为普遍。CRF01_AE或之前的E进化枝和CRF02_AG在HIV-1的传染中是最为普遍的亚型间重组株。遗传亚型和亚型间重组形式的地理分布持续改变，现有的数据提供的是不完全的估计。 感染性HIV颗粒由两条相同的RNA链组成，每条链大约9.2kb长，包装在一个病毒蛋白质核心中。该核心结构由来自宿主细胞膜的磷脂双层包膜围绕，其中所述磷脂双层包膜还包括病毒编码的膜蛋白(Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第4版，W.B.Saunders Company，2000，454页)。HIV基因组具有反转录病毒家族的特征性的5′-LTR-Gag-Pol-Env-LTR-3′组织结构。在病毒基因组的每一端的长末端重复(LTR)充当来自宿主的转录调控蛋白的结合位点，并调控病毒对宿主基因组的整合、病毒基因表达和病毒复制。 HIV基因组编码几种结构蛋白。gag基因编码核壳核心和基质的结构蛋白。pol基因编码病毒复制过程所需的反转录酶(RT)、整合酶(IN)和病毒蛋白酶(PR)。tat基因编码病毒转录物延伸所需的蛋白。rev基因编码促进不完全剪接和未剪接的病毒RNA出核转运的蛋白。vif基因产物增强病毒颗粒的感染性。vpr基因产物促进病毒DNA的入核转运和调控G2细胞周期停滞。vpu和nef基因编码的蛋白质下调宿主细胞CD4的表达，同时增强病毒从受感染细胞的释放。env基因编码病毒包膜糖蛋白，该蛋白可翻译为160千道尔顿(kDa)的前体gp160，并被细胞蛋白酶切割生成外部120-kDa的包膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa的包膜糖蛋白gp41，其在细胞感染中是必需的。(Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，4th edition，W.B.Saunders Company，2000，pp.454-456)。gp140是Env糖蛋白的修饰形式，包含外部120-kDa包膜糖蛋白部分和Env的gp41部分的胞外部分，并具有gp120和gp41两者的特征。nef基因在灵长类慢病毒中是保守的，并且是感染后最早转录的基因之一。在体外研究中，描述了若干种功能，包括下调CD4和I类MHC的表达、改变T-细胞信号转导和激活、以及增强病毒感染性。 HIV感染起始于病毒颗粒上的gp120与靶细胞的细胞膜上的CD4和趋化因子受体分子(例如CXCR4，CCR5)的结合，所述靶细胞诸如CD4+T- 细胞、巨噬细胞和树突细胞。结合的病毒与靶细胞融合，并反转录RNA基因组。获得的病毒DNA整合进入细胞基因组，并指导产生新的病毒RNA，并由此产生病毒蛋白质和新的病毒体。这些病毒体从受感染细胞膜上出芽并在其他细胞建立增殖性感染。这个过程也杀死最初受感染的细胞。HIV也可以间接杀死细胞，这是由于未感染的T-细胞上的CD4受体具有对表达于受感染细胞表面上的gp120的强亲和性。在这些状况中，这些未感染细胞经由CD4受体与gp120的相互作用结合在感染细胞上并融合为合胞体，所述合胞体不能存活。CD4+T-淋巴细胞对免疫防卫反应非常重要，CD4+T-淋巴细胞的破坏是进行性免疫功能障碍的主要原因，而进行性免疫功能障碍是AIDS疾病发展的标志。CD4+T细胞的缺失严重损害人体与大多数外来侵入物作战的能力，尤其剧烈的影响人体对病毒、真菌、寄生虫、某些细菌包括分支杆菌的防御。 对Env糖蛋白的研究表明该病毒具有很多有效的保护性机制而具有很少弱点(Wyatt & Sodroski，Science.1998Jun19；280(5371)：1884-8)。为了与靶细胞融合，HIV-1使用包含gp120与gp41亚基的三聚体Env复合物(Burton等人，Nat Immunol.2004Mar；5(3)：233-6)。与CD4受体和共受体(通常是CCR5或CXCR4)的接合触发了Env复合物的感染潜力。中和抗体或者通过与病毒体表面上成熟的三聚体结合并阻止最初的受体接合事件，或者通过病毒附着后的结合抑制融合过程。(Parren & Burton，Adv Immunol.2001；77：195-262)。在后一种情况下，中和抗体可能与因受体结合而增强或触发暴露的表位结合。尽管中和抗体具有以上潜在的抗病毒作用，目前已知HIV-1已经进化出多种机制保护自身免受抗体的结合(Johnson&Desrosiers，Annu Rev Med.2002；53：499-518)。 HIV-1实验疫苗在人体上和/或非人类的灵长类动物的大部分实验建议一种成功的疫苗应包含可以引起广谱中和抗体(bNab)和强的细胞介导免疫的免疫原。HIV-1包膜糖蛋白(Env)是与病毒进入有关的主要病毒蛋白，也是中和抗体的主要靶点，但是由于免疫逃避策略和包膜蛋白基因剧烈的序列变异性，产生bNab是令人畏缩的任务。(Phogat S，Wyatt R.Curr_Pharm Des.2007，13：213-27；Phogat S，等人J Intern Med.2007262：26-43，Karlsson Hedestam GB，等人Nat Rev Microbiol.2008，6：143-55) 开发有效的疫苗来预防HIV感染或中和HIV感染是困难的。引发广 谱的和有效的中和抗体的能力在开发HIV-1疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含截短的HIV包膜蛋白的分离的肽，其中所述HIV包膜蛋白在天然gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割，所述HIV包膜蛋白包含gp41的MPER，并在跨膜区前被截短。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.25 US 61/478,8571.包含截短的HIV包膜蛋白的分离的肽，其中所述HIV包膜蛋
白在天然gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割，所述HIV包
膜蛋白包含gp41的MPER，并在跨膜区前被截短。
2.权利要求1的肽，其中所述HIV包膜蛋白在其C端包含大约
1-10个亲水氨基酸。
3.权利要求2的肽，其中所述大约1-10个亲水氨基酸是3个赖氨
酸。
4.权利要求1的肽，其中所述gp41的MPER包含4E10表位。
5.权利要求4的肽，其中所述gp41的MPER在其C端包含氨基
酸序列：LWYIK(SEQ ID NO:24)。
6.权利要求5的肽，其中所述HIV包膜蛋白包含位于LWYIK氨
基酸序列(SEQ ID NO:24)C端的并与LWYIK氨基酸序列(SEQ ID NO:24)连
续的大约1-10个非天然亲水性氨基酸。
7.权利要求1的肽，其中所述HIV包膜蛋白衍生自HIV-1毒株，
所述HIV-1毒株归类于选自M、O、N、P的组。
8.权利要求7的肽，其中所述HIV包膜蛋白衍生自HIV-1M组
毒株。
9.权利要求8的肽，其中所述HIV-1M组毒株选自A、B、C、
D、F、G、H、J和K亚型（进化枝）。.
10.权利要求9的肽，其中所述亚型（进化枝）为B进化枝。
11.权利要求9的肽，其中所述亚型（进化枝）为D进化枝。
12.权利要求9的肽，其中所述亚型（进化枝）为C进化枝。
13.权利要求12的肽，其包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具
有85%或更高的相同性的氨基酸序列。
14.权利要求13的肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基
酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。
15.权利要求14的肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基
酸序列具有95%或更高的相同性的氨基酸序列。
16.权利要求15的肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基
酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。
17.权利要求16中的肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨
基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。
18.权利要求17的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基
酸序列。
19.分离的核酸，其包含编码权利要求13-18中任一项的氨基酸序
列的核酸序列。
20.权利要求19的核酸，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:1所
示的氨基酸序列。
21.载体，其包含权利要求19的核酸。
22.宿主细胞，其包含权利要求21的载体。
23.权利要求22的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
24.制备包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%或更高的
相同性的氨基酸序列的肽的方法，所述方法包括在适于蛋白表达的条件下
培养权利要求22或权利要求23的宿主细胞，和分离所述肽。
25.组合物，其包含权利要求13-18中任一项的肽及药用可接受的
载体。
26.在哺乳动物中产生针对HIV的抗体的方法，其包括给所述哺乳
动物施用权利要求25的组合物。
27.权利要求26的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。
28.在哺乳动物中赋予针对HIV的免疫力的方法，其包括给所述哺
乳动物施用权利要求25的组合物。
29.权利要求28的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。
30.权利要求28的方法，包括通过注射给所述哺乳动物施用所述
组合物。
31.权利要求26-30中任一项的方法，其中所述哺乳动物选自人
类、非人灵长类、犬、兔、...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·卡利亚纳拉曼，S·惠特尼，T·C·温科特，V·波罗尼斯，C·阿尔温，G·R·马提亚斯，M·拉奥，M·马洛维奇，F·米卡恩，S·托瓦布特拉，E·桑德斯布埃尔，
申请(专利权)人：先进生物学实验室股份有限公司，美国陆军医学研究和装备司令部，亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US