头孢菌素类抗生素原料物质（7-ACA）生产用变异酶制造技术

本发明专利技术涉及头孢菌素类抗生素（cephalosporin antibiotics）原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变（Point mutation）制造头孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。本发明专利技术的变异CPC酰基转移酶（acylase）与野生型CPC酰基转移酶（acylase）相比，对CPC基质的活性增加5倍至26倍，只通过1个阶段以CPC直接制造7-ACA的效果尤为显著。

【技术实现步骤摘要】
头孢菌素类抗生素原料物质（7-ACA）生产用变异酶
本专利技术涉及头孢菌素类抗生素（cephalosporinantibiotics）原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变（Pointmutation）制造头孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。
技术介绍
头孢菌素C（CephalosporinC，下面简称为“CPC”）是β-内酰胺（β-lactam）类抗生物质，由丝状菌（Filamentousfungus）霉菌（mold）产黄头孢霉(Acremoniumchrysogenum)等一些微生物生产，对革兰氏阴性（Gramnegative）细菌通过阻碍细胞壁合成表现出抗生活性，但其程度非常微弱。因此其主要应用于制造半合成头孢菌素类抗生素（semi-syntheticcephalosporinantibiotics）的原料物质。特别是，从CPC去除氨基己二酰侧链（D—aminoadipoylsidechain）而得到的7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanicacid，下面简称为“7-ACA”）正作为占全球抗生素市场40%以上的大部分头孢菌素类抗生素（cephalosporinantibiotics）的原料物质使用。利用CPC制造7-ACA的现有工艺有化学工艺和酶工艺。化学工艺的反应条件复杂、环境处理费用高，因此现在大部分企业都以环保形酶工艺生产7ACA。目前，企业以商用层面使用的酶工艺通常由两个阶段构成。第1阶段中利用D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase，下面简称为“DAO”）的酶反应，把CPC转化成戊二酰-7-氨基头孢烷酸（Glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，下面简称为“Gl-7-ACA”），第2阶段中通过Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）的酶反应，把Gl-7ACA转化成7ACA（参考图1）。但第2阶段酶工艺的生产收率低。其原因在于第1阶段的酶反应所生成的过氧化氢对基质（CPC）、反应生成物（Gl-7-ACA）及DAO进行攻击。从而有必要开发一种酶工艺，在第1阶段，通过头孢菌素C酰基转移酶（CephalosporinCacylase，下面简称为‘CPC酰基转移酶（acylase）’），从CPC直接制造7ACA。由于CPC酰基转移酶（acylase）不存在于自然界，因此同归改良存在于自然界的各种Gl-7-ACA酰基转移酶（也称作戊二酰酰胺酶（Glutarylamidase：GA））制造CPC酰基转移酶（acylase）。Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）对CPC的活性非常弱，需要提高其活性。用于第2阶段酶工艺的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）多见于各种土壤微生物，索纳韦恩（Sonawane）以如下【表1】的方式把Gl-7-ACA分为5个群组(Sonawane,Crit.Rev.Biotech.26:95-120,2006)。属于同一群组内的，蛋白质大小、氨基酸序列、基质特征、反应特征等非常相似，但不同群组的差别比较大。【表1】Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）的分类属于群组（Group）III的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）存在容易被反应产物7-ACA及无机盐类阻碍活性、酶反应稳定性差的缺点，如果改良群组III的Gl-7ACA酰基转移酶（acylase）、则会继承上面的缺点。但群组II-B的Gl-7-ACA酰基转移酶（acylase）不存在群组III酶的缺点。从而，有必要通过改良群组III-B的Gl-7ACA酰基转移酶（acylase），获得7-ACA生产用第1阶段酶工艺所需变异酶。据此，本专利技术的专利技术人从属于群组II-B的假单胞菌（Pseudomonas）属GK16系列Gl-7ACA酰基转移酶（acylase），发现对CPC的活性增大的变异CPC酰基转移酶（acylase），完成了本专利技术。
技术实现思路
专利技术的课题本专利技术的目的在于提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（CephalosporinC）酰基转移酶（acylase）序列中，F58β氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。本专利技术的另一目的在于提供一种对所述变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因。本专利技术的另一目的在于提供一种包括所述基因的重组表达载体（expressionvector）。本专利技术的另一目的在于提供一种通过所述表达载体（expressionvector）被形质转换（transformation）的宿主细胞。本专利技术的另一目的在于提供一种通过所述表达载体（expressionvector）被形质转换（transformation）的微生物。本专利技术的另一目的在于提供一种包括所述变异CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA(7-Aminocephalosporanicacid)制造用合成物。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造方法。实施方案为了达到上述目的，本专利技术提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（CephalosporinC）酰基转移酶（acylase）序列中，F58β氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。本专利技术提供一种对所述变异CPC酰基转移酶（acylase）进行加密的基因。本专利技术提供一种包括所述基因的重组表达载体（expressionvector）。本专利技术提供一种通过所述表达载体（expressionvector）被形质转换（transformation）的宿主细胞。本专利技术提供一种通过所述表达载体（expressionvector）被形质转换（transformation）的微生物。本专利技术提供一种包括所述变异CPC酰基转移酶（acylase）的7ACA制造用合成物。本专利技术提供一种利用所述CPC酰基转移酶（acylase）的7-ACA制造方法。下面对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α-subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（CephalosporinC）酰基转移酶（acylase）序列中，F58氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。所述变异CPC酰基转移酶（acylase）可追加包括从由Y153βT、F177βL及Y153βT+F177βL构成的群中选择的突变。所述‘Y153βT+F177βL’意味着同时具有Y153βT及F177βL突变。另外，以Y153βT为例说明的话，标记突变的编码应解释为β亚基（序列号4）第153个位置的酪氨酸（TyrosineY）被苏氨酸（ThreonineT）置换。本专利技术的所述变异CPC酰基转移酶（acylase），其对CPC基质的活性高于野生型CPC酰基转移酶（acylase）。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种变异CPC酰基转移酶（acylase），其特征在于：由序列号3所示氨基酸序列的α亚基（α‑subunit）与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC（Cephalosporin C）酰基转移酶（acylase）序列中，F58氨基酸被缬氨酸（Valine）置换。

【技术特征摘要】
2013.01.21 KR 10-2013-00064831.一种突变CPC酰基转移酶，其特征在于：由序列号3所示氨基酸序列的α亚基与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC酰基转移酶序列中，F58β氨基酸被缬氨酸置换。2.根据权利要求1所述的突变CPC酰基转移酶，其特征在于：所述突变CPC酰基转移酶追加存在从由Y153βT、F177βL及Y153βT+F177βL构成的群中选择的突变。3.一种突变CPC酰基转移酶，其特征在于：由序列号3所示氨基酸序列的α亚基与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC酰基转移酶序列为基础，所述突变CPC酰基转移酶存在选自由I45βM/F58βV/Y153βT/F177βL,F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI,I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βA/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βI,I45βC/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,I45βM/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL,以及I45βL/F58β...

【专利技术属性】
技术研发人员：慎镛喆，朴哲，王垠善，郑景化，
申请(专利权)人：爱美科生物株式公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR