生物活性分子的融合制造技术

本发明专利技术提供了融合蛋白，其包含与肠表面结合性结构域连接的酶，优选地饲料酶或食品酶。融合蛋白可用来促进动物中的饲料利用。在具体的实施例中，包含与植酸酶连接的肠表面结合性多肽区段的根据本发明专利技术的融合酶，在肠中显示增加的停留时间，使得给予酶增加的时间来催化相应反应，最终导致改善的饲料利用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物活性分子的融合本专利技术涉及，基于具有如本文下面所讨论的有黏附性质的微生物的适应特性，构建用于增加动物胃肠道中停留时间的多肽和酶的创新方法。本专利技术尤其涉及与参考多肽或酶相比在动物饲料中显示改善性能的新型多肽和酶，例如饲料酶。
技术介绍
农场动物，例如猪和家禽二者是通常被补充饲料酶以提高饲料利用的动物。例如，植酸酶是单胃动物的常用饲料酶，用来改善动物饲料的营养价值并且减少对饲料进行的磷补充，从而降低集中型家畜生产地区的环境污染。就任何饲料酶而言，产生的产物(本文是磷)量是底物(本文是植酸盐)浓度、酶活性和给予酶进行催化反应的时间量的函数，仍需要通过修饰酶制剂或通过开发新型的酶来优化饲料利用和酶活性。技术背景简述乳酸菌属（Lactobacillus）的成员以及其他细菌，特别是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员经常出现在鸟类和哺乳动物的胃肠道中。对于能够定居在该开放流动环境中的细菌，对黏膜的黏附被认为是必要条件。肠的上皮细胞由保护性粘液层覆盖，所述保护性粘液层是糖蛋白和糖脂的复杂混合物，大的糖蛋白黏蛋白（mucin）是主要组分。定居在黏膜上的细菌可在粘液层中找到并且黏附在上皮细胞上。在大部分情况下，已经报道，黏附由蛋白质介导，但是也已经描述了在乳酸杆菌（lactobacilli）细胞表面上的糖类部分与黏膜组分相互作用。总结现有知识已知，微生物菌株黏附至胃肠组分上的能力，基于微生物菌株与胃肠粘液或其主要组分黏蛋白的亲和力，以及微生物菌株与由于肠上皮细胞脱落而陷入粘液中的胶原或当上皮细胞损伤时可获取的胶原的亲和力。还已知，天然肠生细菌(包括芽孢杆菌属的成员)能够形成生物膜并黏附到上皮细胞上，其比不能产生生物膜的细菌在肠道中明显坚持更长时间。所以，自产的胞外生物膜基质对于微生物菌株黏附至胃肠组分的能力而言也起必要的作用。粘液结合蛋白已经主要在乳酸杆菌中表征。已知来自Lactobacillisreuteri1063的基因编码命名为Mub的细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白黏附到粘液组分上。Mub是大的多结构域蛋白质(357kDa)，其作为黏蛋白结合性结构域(MucBP，Pfam06458)共价地附着到细胞表面上。胶原结合性结构域可分为两种类型：Cna型蛋白，其原型是来自Staphylococcusaureus的蛋白A(Pfam05738)，介导细菌黏附至胶原上CBD结构域，其是梭菌胶原酶的一部分。TasA是由芽孢杆菌属的成员产生的生物膜的主要蛋白质组分。已经检测了与EPS(胞外聚合物质)和孢子二者相关的TasA，并且TasA被认为对表面黏附而言是必需的。
技术实现思路
本专利技术尤其涉及与多肽或酶，优选饲料酶或食物酶连接的肠表面结合性多肽区段。本专利技术还涉及编码由酶和肠表面结合性多肽区段组成的这种融合蛋白的DNA、包含该DNA的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产它们的方法，以及它们在例如动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。本专利技术还涉及促进动物中的饲料消化率的方法，其包括给动物施用根据本专利技术的融合蛋白。本专利技术还提供了包含这种融合蛋白的饲料组合物或预混物。包含与酶连接的肠表面结合多肽区段的融合蛋白，特别是融合酶显示肠中增加的停留时间，这导致给予酶增加的时间量来进行催化相应，在饲料酶的情况下最终使得饲料利用改善。基于蛋白质的同源性，本专利技术人已经在候选菌株益生菌BacillussubtilisBSP1的基因组中鉴定了一种胶原结合性蛋白，所述胶原结合性蛋白参与前面提到的黏附现象。该蛋白质是本文后面描述的肠表面结合性多肽区段的第一个例子。根据本专利技术可使用的另一肠表面结合性多肽区段是来自Staphyloccusaureus的胶原结合结构域。其已知为Cna(ProtA)。本专利技术人已经从与Citrobacterbraakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilisBSP1基因bbsp1100和bbsp1101或来自S.aureus的cna基因的一部分构建了含有胶原结合结构域的融合蛋白。在融合蛋白的一些实施方式中，胶原结合性多肽区段是细菌胶原-结合多肽区段。在更具体的实施方式中，胶原结合性多肽区段是梭菌属（Clostridium）胶原结合性多肽区段。在本专利技术的另一实施方式中，胶原结合性多肽区段是胶原酶或细菌胶原酶或梭菌属胶原酶的区段。优选地，区段仅仅是胶原酶的一部分且胶原结合性多肽区段没有胶原酶活性。本专利技术还涉及TasA或来自生物膜胞外基质的另一蛋白质用作间接肠结合性肽的用途，所述间接肠结合性肽来自Bacillussubtilis并且靶向肠中细菌生物膜和孢子二者。已经发现TasA蛋白的序列在如下所示的芽孢杆菌属的成员中高度保守。芽孢杆菌属成员中TasA蛋白序列的保守性。来自国立生物技术信息中心的BLASTP的结果(www.ncbi.nlm.nih.gov)编码TasA，或来自生物膜胞外基质的另一蛋白质的DNA序列可融合在将与肠中生物膜和孢子结合的任何感兴趣的分子(例如肽、酶)的羧基末端或氨基末端部分处。本专利技术人已经从与Citrobacterbraakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilisBSP1的基因bbsp3753构建了包含生物膜结合肽的融合蛋白。本专利技术还涉及与如实施例中所公开的肠表面结合性多肽区段具有至少90%同一性的肠表面结合性多肽区段。术语“融合蛋白”、“融合多肽”或“融合酶”可用来指单个多肽，其包含两个功能区段，例如，肠表面结合性多肽区段和酶，优选地饲料酶多肽区段。融合蛋白可以是任何大小，并且例如，通过单个多肽的两个单体的半胱氨酸二硫化物连接，融合蛋白的单个多肽可以在其功能状态时以多聚体形式存在。多肽区段可以是合成多肽或天然存在的多肽。这种多肽可以是多肽的一部分或可包括突变或更多。术语“肠表面结合”可用来指与鸟类和哺乳动物的胃肠道的表面结合的任何类型的多肽序列，所述结合直接进行（与胶原或胞外基质(ECM)如纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白等结合），或间接地通过胃肠道分泌的粘液（与黏蛋白结合）和在肠上皮细胞脱落之后捕获的分子（胶原和ECM）进行，或通过由微生物群产生并黏附到肠表面上的生物膜或结构（structures）来实现。根据本专利技术的优选的酶选自饲料或食品工业中使用的酶，本文也称为“饲料酶”或“食品酶”。特别有用的酶选自植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)、碱性磷酸酶、淀粉酶，比如，例如，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)或纤维素酶。磷脂酶的例子是磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(EC3.1.4.3)或磷脂酶D(EC3.1.4.4)。本专利技术的植酸酶可以是任何野生型植酸酶或变体植酸酶的变体。在本文上下文中，植酸酶是具有植酸酶活性的多肽，即这样的酶，其催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)向(1)肌醇和/或(2)其单-、二-、三-、四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的水解。因特网本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含与多肽或酶，优选饲料酶或食品酶连接的肠表面结合性多肽区段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.09 EP 11169295.01.一种融合蛋白，其包含与酶连接的肠表面结合性多肽区段，其中所述肠表面结合性多肽区段是细菌胶原结合性多肽区段或粘液结合性蛋白的区段，所述细菌胶原结合性多肽区段选自梭菌胶原酶的胶原结合性结构域CBD，所述粘液结合性蛋白的区段选自Lactobacillusplatarum甘露糖特异性黏附Msa的conA样凝集素结构域和来自LactobacillusrhamnosusGG的SpaB黏附结构域。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述酶为饲料酶或食品酶。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述酶选自植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述淀粉酶为α-淀粉酶。5.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述酶是植酸酶。6.一种经分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：格赫斯兰·舍恩斯，史蒂芬娜·杜沃，奥雷利·布海林，
申请(专利权)人：诺维信专利公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK