单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体1B4E7A6C9，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体6D4H7C8B6。大量测试证实，本发明专利技术的试剂盒可特异、高效地检测单核细胞增生性李斯特菌，但和其它68种常见病原细菌无交叉反应，是一种性能极好的病原细菌检测产品。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体1B4E7A6C9，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体6D4H7C8B6。大量测试证实，本专利技术的试剂盒可特异、高效地检测单核细胞增生性李斯特菌，但和其它68种常见病原细菌无交叉反应，是一种性能极好的病原细菌检测产品。【专利说明】单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒
本专利技术属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988年，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成为新的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与E.coli 0157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。该菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香肠、加工禽类、生肉、鱼、虾、烟熏鱼、生蔬菜。目前单核细胞增生李斯特菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以单核细胞增生李斯特菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及单核细胞增生性李斯特菌快速检测产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测单核细胞增生性李斯特菌的试剂盒。进而，本专利技术提供了一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒，所述的试剂盒含有:(a)固相载体，所述的固相载体上包被有作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9由小鼠杂交瘤细胞系1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765产生；(b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6由小鼠杂交瘤细胞系 6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002 产生。在一优选例中,所述的固相载体为酶标反应板。在另一优选例中，所述的检测抗体带有可检测的标记物。在另一优选例中，所述的可检测的标记物为辣根过氧化物酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的单核细胞增生性李斯特菌菌液，所述的阴性对照为灭菌的李氏增菌肉汤。本专利技术各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求 的描述，本专利技术的特点、目的和优势将更为明显。【具体实施方式】本专利技术人的研究表明，以单核细胞增生性李斯特菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到两株抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体，即1B4E7A6C9，CGMCCN0.8765和6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002，上述两株单克隆抗体的抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与单核细胞增生性李斯特菌结合。以上述单克隆抗体1B4E7A6C9包被酶标反应板作为捕捉抗体，用辣根过氧化物酶标记的上述单克隆抗体6D4H7C8B6作为检测抗体，制作酶联免疫检测试剂盒。结果显示，上述单核细胞增生性李斯特菌检测试剂盒检测灵敏度达到105cfu/ml，具有重复性、准确性好的优点，孔间误差小于5%，板内CV小于3%。其与出血性大肠杆菌0157: H7、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计68种病原细菌均无交叉反应。在此基础上，本专利技术人进而根据双抗体夹心酶联免疫法，经过反复测试，终于获得了一种可快速、高效检测食源性单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒。抗体本专利技术包括两株抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体。本专利技术的两株抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系1B4E7A6C9(CGMCC N0.8765)和小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6(CGMCC N0.8002)分别分泌产生。本专利技术包括具有抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9和6D4H7C8B6的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本专利技术包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本专利技术的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本专利技术还包括与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。对于本专利技术的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region, Q)R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本专利技术包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其⑶R与抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体⑶R具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性。本专利技术不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗体重链；抗体轻链。本专利技术还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系1B4E7A6C9 (CGMCC N0.8765)和6D4H7C8B6 (CGMCCN0.8002)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本专利技术蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本专利技术蛋白序列中。本专利技术还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测单核细胞增生性李斯特菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：(a)固相载体，所述的固相载体上包被有作为捕捉抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9由小鼠杂交瘤细胞系1B4E7A6C9，CGMCC No.8765产生；(b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6，所述的抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体6D4H7C8B6由小鼠杂交瘤细胞系6D4H7C8B6，CGMCC No.8002产生。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，郭慧琴，吴淑燕，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31