本发明专利技术描述了通过为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量在如下酶途径中对微生物进行工程改造使得所述酶活性中的一者或多者受到调节来增加甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法：(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶、(c)乙酸激酶、(d)乳酸脱氢酶、(e)苹果酸酶和(f)丙酮酸脱氢酶。此外，可通过异源表达mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自生物体格氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2和铅黄肠球菌的mvaE和mvaS基因)进一步增大甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术描述了通过为了增加流向甲羟戊酸生产的碳通量在如下酶途径中对微生物进行工程改造使得所述酶活性中的一者或多者受到调节来增加甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法：(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶、(c)乙酸激酶、(d)乳酸脱氢酶、(e)苹果酸酶和(f)丙酮酸脱氢酶。此外，可通过异源表达mvaE和mvaS基因(例如但不限于来自生物体格氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2和铅黄肠球菌的mvaE和mvaS基因)进一步增大甲羟戊酸、戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量。【专利说明】用于增强甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的产量的重组微生物相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2011年4月29日提交的美国临时专利申请N0.61/481，121的优先权，将该专利的公开内容以引用方式全文并入本文。
本公开涉及用于在重组微生物中增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的产量的组合物和方法以及制备和使用甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的方法。专利技术背景R-甲羟戊酸是甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体，该途径将乙酰辅酶A转化成异戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。乙酰辅酶A向甲羟戊酸的转化可由上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)的硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶活性催化。根据葡萄糖经由糖酵解 转化为乙酰辅酶A的摩尔转化率,利用MVA上游途径酶硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶产生甲羟戊酸的理论质量产率为54.8%。商业上，甲羟戊酸已被用作化妆品中的添加剂、用于生产可生物降解的聚合物，并且可具有作为用于合成其他化学品的手性构造块的价值。甲羟戊酸依赖性途径的产物是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是异戊二烯以及类异戊二烯的前体。异戊二烯(2-甲基_1，3_ 丁二烯)是天然橡胶的单体并且还是各式各样的其他天然存在的化合物(统称为类异戊二烯)的共同结构基序(structural motif)异戍二烯此外还是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。类异戊二烯是衍生自类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP的化合物。已鉴定了超过29，000种类异戊二烯化合物并且每年都发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如将类异戊二烯前体分子用作基础构造块以形成类异戊二烯的相对复杂结构的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。在自然界，类异戊二烯发挥的作用多种多样，从作为植物中的天然杀虫剂到促成与肉桂、丁香和生姜相关的香味。此外，制药和化学界将类异戊二烯用作药品、保健营养品、调味剂和农业害虫防治剂。鉴于它们在生物系统中的重要性以及在广泛应用中的有用性，类异戊二烯已成为倍受科学家重视的焦点。获得甲羟戊酸和类异戊二烯的常规手段包括从生物材料(如植物、微生物和动物)提取以及在实验室中部分有机合成或全有机合成。然而，这类手段通常已证明差强人意。尤其对于类异戊二烯，鉴于通常其分子结构的复杂性，有机合成不可行，通常需要若干步骤来获得所需产物。另外，这些化学合成步骤可涉及使用毒性溶剂，同样从生物材料提取类异戊二烯也可涉及使用毒性溶剂。此外，这些提取和纯化方法通常导致所需类异戊二烯收率相对较低，因为生物材料通常仅含有微量的这些分子。不幸的是，获得相对大量的类异戊二烯所涉及的困难已限制了它们的实际应用。在制备异戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯方面的最近的发展公开了用于产生异戊二烯和类异戊二烯的方法，所产生的速率、滴度和纯度可足以满足稳固的商业化生产过程的需求(参见例如国际专利申请公开N0.W02009/076676A2和美国专利N0.7，915，026);然而，仍需要增加异戊二烯和类异戊二烯的产量以及增加异戊二烯和类异戊二烯的产率的改进。本专利技术通过公开组合物和方法以增加作为甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体的甲羟戊酸的产量以及增加衍生自甲羟戊酸的分子如异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量而提供了这些改进。在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物(如杂志文章)。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
技术实现思路
本文提供的专利技术尤其公开了通过在重组微生物中利用特定的基因操纵来增加微生物中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法，该基因操纵导致流向甲羟戊酸生产的碳通量增加。因此，在一个方面，本专利技术提供的是能够增加异戊二烯产量的重组细胞，其中为了增加流向异戊二烯生产的碳通量而对细胞进行工程改造使得来自由如下酶组成的组的一种或多种酶的活性受到调节:柠檬酸合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且其中所述细胞还包含一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；并且其中与尚未为增加流向异戊二烯的碳通量而经工程改造的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生增加量的异戊二烯。在一些方面，该一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA上游途径，其中MVA上游途径核酸选自AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。在一些方面，所述一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)上游途径多肽的核酸为mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，mvaE基因和mvaS基因选自:(a)来自格氏李斯特菌(L.grayi)的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自尿肠球菌(E.faecium)的mvaE基因和mvaS基因；(c)来自鹁鸡肠球菌(E.gal I inarum)的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自铅黄肠球菌(E.casselifIavuS)的mvaE基因和mvaS基因；和(e)来自粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE基因和mvaS基因。在一些方面，一种或多种编码MVA途径多肽的核酸来自MVA下游途径，其中MVA下游途径核酸选自MVK、PMK和MVD核酸。在一些方面，MVK选自马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烧球菌(M.burtonii)甲轻戍酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲轻戍酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戍酸激酶多妝、链球菌(Streptococcus)甲轻戍酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲轻戍酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲轻戍酸激酶多肽和链霉菌CL190甲轻戍酸激酶多肽。在一些方面，该细胞还包含一种或多种编码一种或DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremul本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够增加异戊二烯的产量的重组细胞，其中为了增加流向异戊二烯生产的碳通量而对所述细胞进行工程改造使得一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性受到调节：(a)柠檬酸合酶、(b)磷酸转乙酰酶、(c)乙酸激酶、(d)乳酸脱氢酶、(e)苹果酸脱氢酶、(f)丙酮酸脱氢酶、(g)磷酸葡糖酸内酯酶和(h)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且其中所述细胞还包含(i)一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸和(ii)一种或多种编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；并且其中与尚未为增加流向异戊二烯的碳通量而进行程改造的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生增加量的异戊二烯。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：Z·Q·贝克，M·C·米勒，C·M·派瑞斯，Y·A·普里马克，J·P·普奇，D·H·韦尔斯，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，固特异轮胎和橡胶公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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