食品中乳酸产生细菌的检测和定量制造技术

使用实时PCR快速检测和/或定量乳酸菌的方法和试剂盒，其包括第一条引物、第二条引物和探针。引物和探针的每一种与乳酸菌的16SrRNA基因的不同区域互补。所述方法和试剂盒可以用于检测和/或定量食物如酸奶中的乳酸菌（以支持产品标记）和萨尔萨辣酱中的乳酸菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】使用实时PCR快速检测和/或定量乳酸菌的方法和试剂盒，其包括第一条引物、第二条引物和探针。引物和探针的每一种与乳酸菌的16SrRNA基因的不同区域互补。所述方法和试剂盒可以用于检测和/或定量食物如酸奶中的乳酸菌（以支持产品标记）和萨尔萨辣酱中的乳酸菌。【专利说明】食品中乳酸产生细菌的检测和定量优先权 本申请要求享受于2011年6月27日提交的标题为“食品中乳酸产生细菌的检测和定量”的美国临时专利申请号61/501，470的优先权，其整体内容通过引用并入本文。背景 产生乳酸作为碳水化合物代谢的终产物的细菌群称为乳酸菌。这些细菌可见于自然界中，如在腐烂的植物中，以及在某些食品，如酸奶中。它们包括例如属:乳杆菌氣 iLactobaciIlus、、明串珠菌雇i (Zeuconostoc')、片球菌 M^Pediococcus\ 乳球菌属(Xactococcus、、链球菌属(Streptococcus')、气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobac teria? )、肠球菌属(Mn terococcus )、酒球菌属(Oenococcus )、芽胞乳杆菌属{SporolactobaciIlus )、四联球菌属(Jerageiiococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Zfei1SdJa)的细菌。乳酸菌用于生产酸奶，其中所述细菌产生对产品的特有风味有贡献的乳酸。根据酸奶的生产方法，活的乳酸菌可以存在于最终的酸奶产品中。此类活细菌的存在经常被认为是酸奶中想要的特征。例如，酸奶中活乳酸菌的存在与某些健康和消化益处相关联。乳酸菌将乳中的乳糖发酵，使得具有乳糖不耐受的个体更易于消化酸奶。消费者还将其他健康益处与酸奶中活的且有活性的乳酸菌培养物的存在相关联。因而认为在酸奶中存在活的乳酸菌是想要的并且被一些消费者所优选。National Yogurt Association (N.Y.A.)要求，在制造时酸奶具有高于某一浓度的有活性的乳酸菌培养物并且在储存期结束时进行的活性测试过程中细菌的总数增加一个对数，以用说明产品含有活的且有活性的培养物的封条来标记。Food and DrugAssociation (F.D.A.)已经提出了这样的规定,其同样要求在制造时和在储存期结束时酸奶中存在某一最小量的细菌，以将产品标记为包括活的且有活性的乳酸菌培养物。因而期望定量酸奶中存在的活的乳酸菌，以支持此类标记。在其他食品中，可能不期望存在高水平的乳酸菌。例如，食品中，如萨尔萨辣酱(salsa)产品和熟食类型的(deli style)肉片中乳酸菌的过度生长可以引起令人讨厌的产品质量下降并可以在食品上产生粘层。尽管此类细菌的过度生长对消费者无害，但它却引不起食欲。因而，期望在将此类产品投放到市场之前或在此类产品成分进一步加工之前定量乳酸菌。例如，如果所述产品成分，如用于制备萨尔萨辣酱的蔬菜具有令人难以接受的高水平的细菌，那么可以丢弃这些成分，从而不使用这些成分制备产品。这样，在最终将具有令人难以接受的高水平细菌的产品生产和包装中不会消耗额外投资。熟食类型的肉产品在制造过程中是经过卫生处理的并且在真空或改良的大气中进行包装的；如果此类产品储存于10°C以下，那么期望它们能够维持高感官品质2-4周。然而，由乳酸菌引起的酸败有时候在储存期内发生，这需要生产者进行召回。重要的是能够检测熟食肉产品中的乳酸菌并降低损失和产品召回。传统上，已经使用选择性培养基如酸化的MRS (de Man, Rogosa和Sharpe)琼脂检测并定量食品中的乳酸菌。然而，此类方法耗时，细菌生长需要若干天以达到细菌菌落在培养基平板上可见的足够程度。这种方法称为平板培养，尽管有用，但却在获得结果前需要大量的工作并且延迟。在这段时间里，食物成分或产品在进行进一步加工或投放到市场之前可能要先保持。因而，期望开发定量食品中的乳酸菌的快速方法，来降低加工和产品投放的延迟。更快速的方法使用Bactometer来检测乳酸菌。Bactometer可以用于检测食品如沙拉酱和用于萨尔萨辣酱生产的食物成分如切碎的蔬菜中的乳杆菌(Iactobacilli)。方法可以包括产品在含有对乳杆菌具有选择性的培养基的模块孔中在30± 1°C下孵育24 土I小时。然后将所述模块置于Bactometer系统中，并将菌落计数与检测时间相关联。如果在模块孔中检测到任何生长，那么可以将材料划线到琼脂平板上，其中在选择性培养基上生长后可以进一步鉴定所述菌落。然而，Bactometer通过测量由细菌生长引起的具体物理化学变化来定量细菌。因为直至生长出现才可以检测细菌，所以该方法也是耗时的。此外，一些细菌尽管是活的，但却不可以在所用的培养基中生长。这些细菌称为活而非可培养(VBNC)细菌，并且不能通过Bactometer或培养方法进行检测。因而，期望开发定量食品中的总乳酸菌的快速且不依赖于培养的方法。用于检测细菌核酸的一种不依赖于培养的技术是聚合酶链反应的方法，通常称为PCR，其一般被认为是用于检测给定样品中的核酸的最灵敏和最快速的方法。为了进行PCR，需要与细菌的核酸互补的一对寡核苷酸序列作为引物。一条引物与目标细菌核酸序列的5’端的细菌核酸互补，而另一条引物与目标核酸序列的3’端的细菌核酸互补。对于实时PCR(RT-PCR)的技术，使用这样的探针，其也与两条引物之间的目标细菌核酸序列互补，允许检测和定量目标材料。尽管已知实时PCR的技术可以用于检测和定量目标核酸序列，但是它们依赖于鉴定独特序列，以充当引物和探针，并且这种鉴定可能是有挑战性的。此类序列必须不仅对目标材料独特，而且还不能与其自身结合来形成引物二聚体。所述探针还应该满足设计指导方针，包括在探针的5’端不具有鸟嘌呤残基；具有适当的Tm值(解链温度);尽可能地短，但至少具有13个核苷酸；不具有相同核苷酸串(runs of identical nucleotides);及其他特征。因而，鉴定满足对于提高实时PCR的成功可能性所必需的这些指导方针的第一条和第二条引物序列以及探针序列可能是困难的。概述 本专利技术的实施方案允许使用实时PCR的技术快速且特异性检测和定量乳酸菌。实施方案还包括用于检测乳酸菌的试剂盒，其包括第一条引物序列、第二条引物序列，和探针序列，其中每条序列与乳酸产生细菌的16S rRNA基因的不同区域互补。例如，在一些实施方案中，第一条和第二条引物序列和探针序列的每一种与SEQ.1D.N0.4的不同区域互补。在一些实施方案中，用于PCR检测乳酸菌的试剂盒包括:包含SEQ.1D.N0.1的第一条引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二条引物，和包含SEQ.1D.N0.3的探针。在一些实施方案中，探针包括荧光团，如羧基荧光素。在一些实施方案中，试剂盒还包括膜不透性染料。 在其他实施方案中，本专利技术包括检测样品中乳酸菌的方法，其包括将样品稀释，将样品离心以产生沉淀，使用沉淀进行细菌DNA的提取，将所提取的细菌DNA与包含以下的PCR试剂组合:包含SEQ.1D.N0.1的第一条引物、包含SEQ.1D.N0.2的第二条引物、包含SEQ.1D.N0.3的探针、DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸，使组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于PCR检测乳酸菌的试剂盒，其包含：包含SEQ. ID. No. 1的第一条引物；包含SEQ. ID. No. 2的第二条引物；和包含SEQ. ID. No. 3的探针。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y胡，MC墨菲，K斯蒂芬斯，
申请(专利权)人：通用工厂公司，
类型：发明
国别省市：美国;US