活性内生菌的检测制造技术

本发明专利技术提供了一种检测植物中活性内生菌的存在的方法，所述方法包括在植物的嫩叶或其提取物中检测内生菌的存在，其中在所述嫩叶或其提取物中检测到所述内生菌的存在指示植物中活性内生菌的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了一种检测植物中活性内生菌的存在的方法，所述方法包括在植物的嫩叶或其提取物中检测内生菌的存在，其中在所述嫩叶或其提取物中检测到所述内生菌的存在指示植物中活性内生菌的存在。【专利说明】活性内生菌的检测
本专利技术涉及草地农业领域。本专利技术涉及检测草类植物中的活性内生菌(endophyte)的方法。
技术介绍
内生真菌感染许多温带草类。内生菌可产生生物碱，其被认为能在一定程度上对自然产生该内生菌的植物产生害虫以及可能的疾病防护作用(Rowan和Latch，1994)。此外，至少一些内生菌的存在可能是草场中选定草类的竞争持久性所必需的(Fletcher andEaston,2000)。然而，在用于草地农业生产的改良的草类培养品种中，许多主要的天然内生菌感染也导致食用这些草类的动物的严重疾病。这些疾病的例子包括高羊茅中毒(Stuedemann和Hoveland，1988)和黑麦草蹒跚(Fletcher等，1999)。这些症状是动物对一定植物生长条件下产生的生物碱的复杂的毒性反应。由于这样的动物中毒导致草地农业系统的极大经济损失。可用选定的仅产生期望的生物碱的有益内生菌人工感染草类品系。无菌培养的内生菌可以用于感染草苗，在无菌条件下生长，然后选择期望的品质并繁殖用于商业用途。该技术的三个显著例子已被AgResearch公司的草地部门开发:具有END0SAFE?内生菌的GREENSTONE? 四倍体杂交黑麦草(NZ专利233083);具有ARl内生菌的各种多年生和杂交黑麦草(Fletcher和Easton，2000);以及具有MaxQ?内生菌的高茅草培养品种(U.S.专利 N0.6，111，170)。在制备具有有益内生菌株系的种子用于商业生产时，种子批次可包含其它污染和潜在有害的内生菌株系。因此，提供可供检测这样的种子批次和/或育种材料中内生菌含量(有益和/或无益)的方法是重要的。此外，了解存在的任何内生菌是否有活性(即能在植物内生长形成稳定的共生关系)也是重要的。已经研发了许多方法来检测植物组织和种子中内生菌的存在。一些方法如显微镜法(用诸如苯胺蓝等化合物组织学染色)，仅检测内生菌的存在，而不能容易或可靠地确认内生菌的种类或株系。另外，目前使用显微镜的方法不能区别活性和无活性的内生菌。单克隆抗体试剂盒可以通过确定产生何种生物碱来粗略地指示存在的内生菌类型。但是该试剂盒也不能确定实际的种类或株系。高效液相色谱法(HPLC)可用于对由内生菌产生的毒性生物碱进行定量，其中所述生物碱与存在的内生菌株系相关。然而，该方法也不能区分活性和无活性的内生菌。核酸方法如聚合酶链式反应(PCR)已经用于检测草种和植物组织中具体的株系的存在，但是目前的方法灵敏度低，并且在可用于检测内生菌的存在之前，需要很长的时间使得植物生长至合适的发育阶段。此外，目前的方法不能区分活性和无活性的内生菌。同工酶可用于对内生菌定性，但是该方法也不能区分活性和无活性的内生菌。目前检测活性内生菌的存在的工业标准方法需要活的内生菌从宿主植物组织长出到无菌介质上以确定其活力。酶联免疫分析(ELISA)通常用于基于生物碱性质来确定感染的百分比，并且蛋白质印迹(蛋白质免疫印迹)分析技术用于确定内生菌的存在或缺失。该方法是费力且耗时的。此外，这样的血清学方法往往不能区分产生类似的生物碱性质的内生菌株系。因此，目前的许多可用方法都是耗时且昂贵的。一些方法还缺乏灵敏度，并且/或者不能以从种子到结果的快速周转时间进行多样品筛选。此外，如上所述，许多这样的方法不能区分活性和无活性的内生菌的存在。本专利技术的一个目的在于提供一种检测植物中活性内生菌的存在的方法，其能够克服现有技术中的一种或多种问题，并且/或者至少能够为公众提供有益的选择。
技术实现思路
申请人:已专利技术了一种快速检测植物中活性内生菌的存在的方法。利用本专利技术的方法，通过检测发芽植物的第一片叶子中的内生菌的存在，能够快速鉴别含活性内生菌的植物(而不是含有无活性的内生菌的那些植物)。该方法允许及早鉴别活性有益的内生菌以及任何活性污染内生菌。本专利技术的方法能够检验(手动或自动化方法)植物组织(例如来自成批种子的样品的发芽幼苗)，进而确定具体的活性有益和/或活性无益的内生菌种类和株系的存在。因而，本方法可以用于商业生产的种子批次的质量控制，用以确定活性有益或活性污染的内生菌的百分比。活性内生菌 的检测方法在本专利技术的第一个方面，提供了一种检测植物中活性内生菌的存在的方法，所述方法包括在所述植物的嫩叶或其提取物中检测内生菌的存在，其中在所述嫩叶或其提取物中检测到所述内生囷的存在指不所述植物中活性内生囷的存在。由叶子数目限定嫩叶在一个实施方案中，所述嫩叶是在所述植物的种子发芽后由该植物产生的前5片叶子之一。所述嫩叶优选地为所述植物的种子发芽后由该植物产生的前4片叶子之一，更优选地为前3片叶子之一，更优选地为前2片叶子之一。在一个优选的实施方案中，所述嫩叶是在所述植物的种子发芽后由该植物产生的第一片叶子。通过使用早期叶子(优选为第一片叶子，而不是更成熟的植物组织)，可能极大地缩短种子从发芽到检测活性内生菌的时间。因此，本专利技术的方法是快速的，这非常有利于畜牧业/种子产业。由苗龄限定嫩叶在一个实施方案中，所述嫩叶是在所述植物的种子发芽后4周之内、更优选地在3周之内、更优选地在2周之内产生的来自该植物幼苗的叶子。在一个实施方案中，所述嫩叶是在植物的种子发芽后小于14天、优选地小于13天、优选地小于12天、优选地小于11天产生的来自该植物幼苗的叶子。在一个优选的实施方案中，所述嫩叶是在所述植物的种子发芽约10天后产生的来自该植物幼苗的叶子。更优选地，所述嫩叶是在所述植物的种子发芽10天后产生的来自该植物幼苗的叶子。通过使用嫩叶(优选为发芽约10天后产生的来自该植物幼苗的叶子，而不是更成熟的植物组织)，可以缩短种子从发芽到检测活性内生菌的时间。因此，本专利技术的方法是快速的，这非常有利于畜牧业/种子产业。由发育定义嫩叶优选地，所述嫩叶来自这样的幼苗，所述幼苗已经充分生长使得所述叶子与胚芽鞘分离。切下嫩叶在一个实施方案中，在用于该方法之前，切下所述嫩叶使其与所述植物的其他组织或器官基本上分离。在又一个实施方案中，在用于该方法之前，切下所述嫩叶使其与所述植物的胚芽鞘、以及其他组织或器官基本上分离。在又一个实施方案中，在用于该方法之前，切下所述嫩叶使其与所述植物的胚芽鞘和任何附着的种子、以及其他组织或器官基本上分离。活性本文所用的术语 “活性”是指能够生长。优选地，“活性”内生菌能够在植物内生长以形成稳定的共生关系。检测活性内生菌的存在本专利技术人发现，仅活性内生菌(无活性的内生菌不能)能够进入发芽幼苗的嫩叶(特别是第一次出叶)生长，并且示出使用本专利技术的方法能够在嫩叶阶段区分含活性内生菌的植物以及不含活性内生菌的植物。因此，本专利技术涉及检测活性内生菌的存在。当真菌生物量通常非常低时，本专利技术方法的灵敏度足以检测并鉴定嫩叶中的活性内生菌。在本专利技术的一个实施方案中，通过以下方法中的任意一种检测嫩叶中内生菌:光学显微镜、染色和光学显微镜、电子显微镜、基于抗体的方法、基于单克隆抗体的方法、酶联免疫分析(ELISA)、高效液相色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测植物中活性内生菌存在的方法，所述方法包括在所述植物的嫩叶或其提取物中检测内生菌的存在，其中在所述嫩叶或其提取物中检测到所述内生菌的存在指示所述植物中活性内生菌的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德·大卫·约翰逊，克里斯蒂娜·罗莎莉·沃伊赛，
申请(专利权)人：格拉斯兰兹技术有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ