一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法技术

本发明专利技术涉及功能高分子材料与生物分离领域，特别涉及一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法，首先通过Friedel–Crafts反应在超大孔聚苯乙烯（PS）微球表面引入原子转移自由基聚合反应（ATRP）引发剂，然后利用非均相ATRP反应在超大孔PS微球表面接枝温敏性聚合物刷，得到温敏型超大孔生物分离介质。通过选择疏水性单体、pH敏感性单体与温敏单体混合，还可以制得兼具疏水作用与离子交换作用的温敏型超大孔生物分离介质。在优化的反应条件下接枝的温敏聚合物刷不仅温度响应性好，而且能保持PS微球的超大孔结构。初步的分离实验结果表明，仅通过改变温度该温敏型超大孔生物分离介质就能在1806cm/h下将两种蛋白混合物分开，说明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质在规模化蛋白分离纯化领域很有潜力。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及功能高分子材料与生物分离领域，特别涉及，首先通过Friedel–Crafts反应在超大孔聚苯乙烯（PS）微球表面引入原子转移自由基聚合反应（ATRP）引发剂，然后利用非均相ATRP反应在超大孔PS微球表面接枝温敏性聚合物刷，得到温敏型超大孔生物分离介质。通过选择疏水性单体、pH敏感性单体与温敏单体混合，还可以制得兼具疏水作用与离子交换作用的温敏型超大孔生物分离介质。在优化的反应条件下接枝的温敏聚合物刷不仅温度响应性好，而且能保持PS微球的超大孔结构。初步的分离实验结果表明，仅通过改变温度该温敏型超大孔生物分离介质就能在1806cm/h下将两种蛋白混合物分开，说明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质在规模化蛋白分离纯化领域很有潜力。【专利说明】
本专利技术属于功能高分子材料与生物分离领域，特别涉及一种快流速温敏型超大孔生物分离介质及其制备方法。
技术介绍
多肽和蛋白质等生物分子目前主要通过反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱等模式中的一种或它们的组合来得到分离。其中反相色谱是分离、纯化和研究多肽中应用最广的色谱技术之一，然而有机溶剂的使用可能会导致多肽生物活性的损失以及进一步应用。疏水色谱虽然无有机溶剂的加入，但蛋白质和多肽与固定相的疏水作用，是靠流动相中高盐浓度制造的“盐析”效应来促进的，这个过程容易引起蛋白质结构的变化，导致产品收率和生物活性降低。与疏水色谱相反，在离子交换色谱中通过静电力结合到固定相上的蛋白质和多肽是通过提高流动相中的盐浓度来洗脱的，盐浓度梯度的变化同样容易导致生物分子活性损失。上述传统色谱技术在分离生物大分子方面的局限性促进了科研人员对新型色谱分离模式的开发热情。温敏性聚合物由于能对外界微小的刺激(温度)产生明显的物理化学性质改变(亲水《疏水，溶胀《收缩)，已经在药物控释、生物偶联、传感器、微流控、细胞培养基等领域得到了广泛应用(Adv.Funct.Mater.，2006, 16:1865-1872)。利用温敏聚合物制备的温敏型固定相是近年来出现的一种 新型分离介质，与常规介质的小分子配基不同，其配基是聚合物高分子链。由于高分子链能在低临界溶解温度(LCST)附近发生明显的聚合物链伸展《I收缩变化(即在不改变流动相组成的情况下固定相表面发生亲水^^疏水性质转变)，在分离结构复杂、稳定性差、具有生物活性的昂贵生物分子和药物时同样具有很大潜力，近年来受到极大关注(Anal.Methods, 2012, 4:34-43)。除了温度梯度，在温敏聚合物中添加修饰组分以增强疏水力或引入静电力也可以有效提高分离效果。利用温敏型/PH敏感型聚合物固定相分离类固醇(Langmuir，2011，27，10830-10839)、蛋白质(I&EC Res.，2012，51:3015-3022)、多肽(J.Chromatogr.A, 2011，1218:2079-2084)、寡核苷酸(Lab Chip, 2006，6:526-533)在最近的文献中都有报道。温敏型介质分离生物活性物质的主要优势在于生物分子活性损失少、分离成本低、环境友好毒性低(不需要有机溶剂)、易于操作，被称为“绿色”固定相，有望成为新一代生物分离介质。目前温敏功能层主要通过以下三种方法结合到分离基质表面:原位聚合法(J.Chromatogr.A，2011，1218:2079-2084)、化学接枝法(J.Chromatogr.A, 2009, 1216:8722-8729)和原子转移自由基聚合方法(ATRP)(Langmuir, 2011, 27:10830-10839)。前两种方法，聚合物链长度、接枝密度都无法有效控制，温度敏感性不强，并且均用于分析色谱模式，分离时间长，处理量低。ATRP反应是一种有效、便捷的制备活性高分子聚合物和设计高分子的方法，反应条件温和，适用单体范围广泛，聚合物分子量和结构可控，利用其接枝温敏聚合物刷可以有效提高分离效率(Langmuir, 2011，27，10830-10839)。虽然温敏型聚合物在生物分离领域展现了良好的前景，但大多用于分析模式，随着人们对食品医药领域生物活性产品需求的增加(2012年市场份额大于1000亿美元)，亟需一种成本低、效率高的制备性分离介质的诞生，温敏型分离介质在这方面具有很大的潜力。但温敏型分离介质作为一种有效的工业分离手段还有待时日，主要存在以下问题:I)大多数温敏型介质孔径小(<30nm)，传质速率慢，处理量低，只能用于分析模式，并且在分离蛋白等生物大分子方面的报道较少；2)文献中温敏型介质的基质主要以硅胶和多糖软凝胶为主。前者化学稳定性差，不耐酸碱，工业应用时清洗困难；后者机械强度低，只能在低压下使用，分离速度慢，很难工业放大。
技术实现思路
本专利技术针对现有温敏型生物分离介质存在的问题，采用超大孔聚苯乙烯微球为基质，通过选择温敏性单体或温敏性单体与其它功能单体复合，利用ATRP反应在其表面接枝温敏功能聚合物刷，得到一种快流速温敏型超大孔生物分离介质，该介质机械强度高，生物相容性好，介质的超大孔道有效克服了现有层析介质由于孔道狭窄很难进行蛋白质快速分离的问题，能够实现蛋白质等生物大分子的快速分离和规模化制备，可广泛用于生物分离及医药食品领域，在生物大分子分离工程领域具有很大的潜力和优势。本专利技术提出了，包括如下步骤:步骤1:参考文献方法(离子交换与吸附，2005, 21 (4): 289-296)，在酸性催化剂作用下，利用Friedel-Crafts反应将超大孔聚苯乙烯微球的苯环卤烷基酰化或卤甲基化,得到具备下述通式的物质A:【权利要求】1.，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤: 步骤1:在酸性催化剂作用下，利用Friedel-Crafts反应将超大孔聚苯乙烯微球的苯环卤烷基酰化或卤甲基化，得到具备下述通式的物质A: 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤I所述的卤烷基酰化的试剂为氯乙酰氯、溴乙酰溴、2-氯异丁基酰氯或2-溴异丁基酰溴的任一种，卤甲基化的试剂为氯甲醚、溴甲醚的任一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2中所述的功能单体为温敏性单体、温敏性单体与疏水性单体的混合物、温敏性单体与pH敏感性单体的混合物或温敏性单体、疏水性和pH敏感性单体的混合物中的任一种；步骤2的反应温度为10-90°C，反应时间l-30h,功能单体浓度0.1-5M，功能单体与物质A的摩尔比范围10:1-100: 1，物质A与催化剂的摩尔比范围10:1-1:2，配体的加入量为催化剂的0.5-3倍。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2中所述的温敏性单体与疏水性单体的混合物按照温敏性单体:疏水性单体摩尔比为85:15-97:3混合；所述的温敏性单体与pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体:pH敏感单体摩尔比为80:20-98:2混合；所述的温敏性单体、疏水性和pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体:疏水性单体:pH敏感单体摩尔比 80:10:10-95:3:2 混合。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于步骤2中的所述的温敏性单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)或者2-(2-甲氧乙氧基)甲基丙烯酸酯(MEO2MA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤1：在酸性催化剂作用下，利用Friedel‑Crafts反应将超大孔聚苯乙烯微球的苯环卤烷基酰化或卤甲基化，得到具备下述通式的物质A：R为H2CC=O，CH2或(CH3)2CC=O，X可为Cl，Br步骤2：采用原子转移自由基聚合（ATRP）反应在物质A上接枝温敏性聚合物刷，将步骤1中物质A置于反应瓶1中，抽真空除氧，待用；接着将催化剂（catalyst）、功能单体﹑配体（ligand）﹑醇水混合物在反应瓶2中溶解混匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将反应瓶2中的液体引入反应瓶1；最后将反应瓶1置于恒温水浴振荡器中反应一段时间后得到温敏型超大孔聚苯乙烯微球；反应式如下：W为功能单体；X为Cl，Br步骤3：将步骤2中得到的温敏型超大孔聚苯乙烯微球依次用无水甲醇、无水乙醇、一定浓度的乙二胺四乙酸（EDTA）、丙酮、去离子水充分洗涤，再进行索氏抽提，真空干燥后即得温敏型超大孔生物分离介质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曲剑波，陈艳丽，宦关生，张晓云，黄方，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东;37