本发明专利技术提供一种用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；还包括多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的上述所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽；及所述多肽或多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品或用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。本发明专利技术提出了一种利用多肽细胞表面抗原进行特异性识别的新方法，并发明专利技术了一种新的富集、分离和检测CTC的多肽-磁性纳米颗粒物质，提供了一种富集、分离和检测CTC的快速、准确和低成本的检测技术，为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗及预后提供了有效方法。
【技术实现步骤摘要】
用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种多肽，尤其涉及一种可以用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，该方法准确、快速，大大降低了富集、分离和检测上皮细胞粘附因子(EpithelialCell Adhesion Molecule, EpCAM)高表达的 CTC 细胞的成本。
技术介绍
癌症是威胁人类的重大疾病之一，侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特征之一，肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT),从而具有流动特性,进入外周血中，就形成了循环肿瘤细胞(CTC)。因此在外周血中检测到CTC预示着有可能发生肿瘤转移，另外，美国哈佛医学院的最新研究表明，原位肿瘤组织能够吸引CTC细胞再次浸润到原发肿瘤上从而促进肿瘤的生长(可参考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin.0ncol.2009，6，339-351 ；J.Kaiser等人，Science2010, 327, 1072-1074)，因此CTC的高效检测对于研究肿瘤转移机制有指导意义，而且可以对指导肿瘤治疗、判断治疗效果、推断预后提供可靠参考，对监测肿瘤的转移或复发都有非常重要的意义。自1869年澳大利亚医生Thomas Ashworth在显微镜下首次从一名男性肿瘤转移患者的血液里观察到CTC以来，CTC的研究引起了人们的广泛关注。CTCs在血液中的含量极少(约几个CTCs/105~IO7个单个核细胞)，人们对CTC的富集检测方法进行了不断的探究。这些方法可以分为两类:机械法和免疫分离法(可参考P.Paterlin1-BrechOt &N.L.Benali, CancerLett.2007,253, 180-204)。前者是根据CTC与血液中的白细胞和红细胞的细胞直径及细胞密度不同，通过过滤或密度梯度离心的方法实现的；后者则主要是利用CTC表面的一些特异性标记物如:常见的上皮标记物细胞角蛋白(Cytokeratins, CKs)>上皮细胞粘附因子(EpCAM)、肿瘤胚胎抗原(Carcino Embryonic Anti gene, CEA)和人表皮生长因子受体 2 (HumanEp i derma I Growth Factor Receptor2, HER2)等，通过抗原抗体特异性结合反应实现CTC与血液中其他细胞的分离(可参考H.Xu等人，Biomaterials2011，32，9758-9765 ；S.L.Stott 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2010,107，18392-18397 ；S.Nagrath 等人，Nature2007,450, 1235-1239 ;Α.-E.Saliba 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2010,107, 14524-14529 ;X.Wang 等人，Cancer Res.2011，71，1526-1532)。与免疫分离方法相比，机械分离方法灵敏度底，分离的特异性差。因此人们不断改进免疫分离技术，试图提高分离效率。第一种被广泛用来检测CTC的是CellSearch，它是通过在磁珠上包被抗-EpCAM抗体实现对上皮组织来源的肿瘤细胞的识别，如乳腺癌和结肠癌细胞。CellSearch在临床上成功地用来评价肿瘤预后效果，于2004年被美国FDA批准用来作为乳腺癌转移的预后诊断方法；为了提高CTCs检测的准确度，麻省总医院(MGH)团队用一种叫做CTC Chip的新装置来检测CTC，CTC Chip有78000个微小的包被了抗-EpCAM抗体的作用位点，这样当血液流过时，只有肿瘤细胞被识别出来，MGH团队用于肝癌转移患者的临床测试结果于2007年在Nature上发表。其后，该组又用CTC Chip收集肺癌患者的CTC并对其进行了基因分析。最近，Andrew Wang课题组报到用抗体包被的纳米氧化铁颗粒分选CTCs的效率比用微球的分选方法效率大大提高，最大分选率达到84%。在这些免疫分析中，上皮细胞粘附因子(EpCAM)和CKs是CTC检测的常用表面标志物。然而，由于抗体生产成本及生产技术的限制，导致这种基于EpCAM和CKs抗体检测CTC的技术成本较高，如CellSearch检测一个血样需要约600美元，因此寻找能与EpCAM和CKs特异性靶向结合的新型的化合物有重要的意义。近年来，研究者们在利用多肽进行肿瘤细胞的识别，靶向肿瘤细胞表面方面展开了广泛的研究，人们已经从天然及合成的多肽中筛选出大量能分别靶向不同肿瘤细胞不同作用位点的多肽化合物(可参考M.Shadidi &M.Sioud，FASEB J.2003,17, 256-258 ；M.Shadidi & M.Sioud, DrugResist.Updates2003，6，363-371)。对于高转移肿瘤的 CTC 的检测，发展特异性识别EpCAM、CKs的多肽具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测CTC成本高的不足，提供一种富集、分离和检测CTC的新思路和新方法。本专利技术的一个目的是设计能够特异性识别CTC的多肽片段替代现有的抗-CTC抗体，从而降低检测成本。本专利技术的另一个目的是结合现有的纳米技术，将特异性识别多肽与纳米颗粒偶联，即提供一种多肽-纳米颗粒，提高对血液中稀少CTC的检测效率。本专利技术的又一个目的是提供特异性识别多肽-纳米颗粒在监测肿瘤的转移或复发肿瘤治疗效果评价方面的用途。除非另外指明，本文中的“多肽-磁性纳米颗粒”是指“多肽在表面修饰的磁性纳米颗粒”。除非另外指明，本文中的“ 2E7，2E8，2E9 ”分别表示“阴性细胞数为2 X IO7个，2X IO8 个，和 2 X IO9 个”。除非另外指明，本文中的“结合率”是指“一个磁性纳米颗粒的活性位点上修饰了多少条多肽”。[0011 ] 除非另外指明，本文中的“分离率”是指“分离的细胞样品的个数占加入的细胞样品个数的比例”。针对上述目的，本专利技术的技术方案如下:一方面，本专利技术提供一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:tool 4] VrrdaprfsmqgldacggnX1X2 (X3) nl (X4) n2其中，X1为 Cys 或 Asn ;X2 SCys 或 Asn;X3 为 Asn，nl=0 或 I ;X4 为 Asn，n2=0 或 I。优选地，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，所述多肽可通过特异性结合细胞上皮粘附因子(Epithelial Cell AdhesionMolecule, EpCAM)识别循环肿瘤细胞。另一方面，本专利技术提供一种多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的上述本专利技术所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽。优选地，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5~4:5。优选地，所述多肽和磁性纳米颗粒的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：VRRDAPRFSMQGLDACGGNX1X2(X3)n1(X4)n2其中，X1为Cys或Asn；X2为Cys或Asn；X3为Asn，n1=0或1；X4为Asn，n2=0或1。
【技术特征摘要】
1.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列为下述SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列:VrrdaprfsmqgldacggnX1X2 (X3) nl (X4)也 其中，X1 SCys 或 Asn ；X2 为 Cys 或 Asn ；X3 为 Asn, nl=0 或 I ；X4 为 Asn, n2=0 或 I。2.根据权利要求1所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID N 0:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。3.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的权利要求1或2所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽。4.根据权利要求3所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01: 5~4:5。5.根据权利要求4所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1: 5~3:5。6.根据权利要求3至5中任一项所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒，优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为600~1500nm,更优选地,所述粒径为800nm。7.根据权利要求3至6中任一项所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤: 1)制备权利要求1或2所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽； 2...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琛，白林灵，杜一萌，杨延莲，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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