本发明专利技术公开了一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，属于转基因水稻品种的定性检测领域。本发明专利技术首先公开了用于检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的8对特异性PCR检测引物对。在此基础上，本发明专利技术建立了一种特异性强、灵敏度高的转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法。本发明专利技术进一步公开了转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测试剂盒。特异性、灵敏度和检出限实验证明，本发明专利技术转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1品种的定性PCR检测方法特异性强、灵敏度高、检出限好，适于转基因G6H1水稻及其衍生品种制品的定性检测。
【技术实现步骤摘要】
转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法
本专利技术涉及转基因水稻品种的定性PCR检测方法，尤其涉及转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测引物、定性检测方法及检测试剂盒，属于转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测领域。
技术介绍
转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1品种，是将密码子经过优化的杀虫基因HJC-1和抗草甘膦基因G6导入到栽培水稻品种“秀水110”而得到的，插入序列全长约10.2kb(图1)。HJC-1是一个CrylAb 和Vip3H的融合基因，这两个基因的融合具有对鳞翅目害虫更广谱的杀虫能力。G6是一个新的5-烯醇式丙酮酸3-磷酸合成酶基因(EPSPS)，它和其它抗草甘膦基因相似性低。温室试验、中间试验和环境释放试验表明，转HJC-1和G6-EPSPS基因抗虫耐除草剂水稻G6H1的抗虫和抗草甘膦能力良好。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。专利CN102162012B “转基因水稻科丰6号的定性PCR检测方法”公开了转基因水稻科丰6号的旁侧序列的定性PCR检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种针对转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的特异性强、灵敏度高的定性PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供用于检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的特异性PCR检测引物对；本专利技术的目的之二是提供一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法；本专利技术的目的之三是提供一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术根据G6H1水稻的插入序列设计引物，根据插入序列的5’端旁侧序列(插入序列的5’端旁侧序列为SEQ ID N0.18所示；其中，1-480位为水稻基因组序列，481-872位为外源序列)设计8条引物，根据插入序列的3’端旁侧序列(插入序列的3’端旁侧序列为SEQ ID N0.19所示；其中，1-518位为外源序列，519-831为水稻基因组序列)设计9条引物，分别将上述引物进行配对，目标序列长度在100~400bp之间。以质量分数分别为100%、1%和0.1%的G6H1水稻和非转基因水稻秀水110DNA为模板，应用常规PCR反应条件和反应体系，对21对引物进行PCR扩增，从中筛选出扩增结果较好的8对特异性检测引物，能够应用于定性检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种，所述8对特异性PCR检测引物对的具体序列如下:弓丨物对1:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6的核苷酸序列组成；弓丨物对2:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成；弓丨物对3:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.6的核苷酸序列组成；弓丨物对4:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成；引物对5:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7的核苷酸序列组成；弓丨物对6:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成；弓丨物对7:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7的核苷酸序列组成；弓丨物对8:由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.15的核苷酸序列组成。为了进一步提高检测的特异性和灵敏度，本专利技术对上述8对引物检测的灵敏度进行了筛选实验。实验结果表明，由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7组成的引物对5以及由SEQID N0.1和SEQ ID N0.7组成的引物对7具有较高的检测灵敏度(均可达到0.1%的检测灵敏度)，远远优于其它6对引物的检测灵敏度；本专利技术以由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7组成的引物对5以及由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7组成的引物对7作为候选引物，进行下一步的PCR反应体系和反应程序优化。结果表明，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7组成的引物对7在G6H1水稻质量分数为0.1 %时的扩增效率高于由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7组成的引物对5。由上述实验结果可见，采用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示的引物对7作为引物定性检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种不仅具有更佳的检测灵敏度，而且具有最好的扩增效率；因此，本专利技术最优选采用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示的引物对7作为引物定性检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种。本专利技术的目的之二是提供一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，该方法包括以下步骤:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；⑵以提取的DNA为模板，分别以引物对1-8为扩增上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出目的条带，则待检测的水稻样品是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种；如果从待检测的样品中未能扩增出目的条带，则待检测的水稻样品不是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种。优选的，一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，该方法包括以下步骤:(1)提取待检测水稻样品的DNA; (2)以提取的DNA为模板，以SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.7所示核苷酸为扩增上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出290bp的条带，则待检测的水稻样品是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种；如果从待检测的样品中未能扩增出290bp的条带，则待检测的水稻样品不是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种。本专利技术还提供了另一种较优的转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，该方法包括以下步骤:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；⑵以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示核苷酸为扩增上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出243bp的条带，则待检测的水稻样品是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种；如果从待检测的样品中未能扩增出243bp的条带，则待检测的水稻样品不是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种。其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性、灵敏度均有一定的影响；本专利技术优化了 PCR反应体系中引物终浓度以及退火温度，优化实验结果发现退火温度为58°C，引物终浓度为0.4 μ mol/L，扩增效率高，检测结果的特异性最强，灵敏度最闻。本专利技术中所述的PCR反应体系可参考以下方法建立:PCR反应体系总体积为25.0 μ L，其中，10 XPCR缓冲液2.5 μ L，25mmol/L氯化镁溶液 1.5 μ L, dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L) 2.0 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L, 10 μ mol/L下游引物0.5 本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的特异性PCR检测引物对，其特征在于，选自以下8对引物中的任意一对：引物对1：由SEQ ID No.2和SEQ ID No.6的核苷酸序列组成；引物对2：由SEQ ID No.2和SEQ ID No.5的核苷酸序列组成；引物对3：由SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的核苷酸序列组成；引物对4：由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的核苷酸序列组成；引物对5：由SEQ ID No.4和SEQ ID No.7的核苷酸序列组成；引物对6：由SEQ ID No.1和SEQ ID No.5的核苷酸序列组成；引物对7：由SEQ ID No.1和SEQ ID No.7的核苷酸序列组成；引物对8：由SEQ ID No.10和SEQ ID No.15的核苷酸序列组成。
【技术特征摘要】
1.用于检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的特异性PCR检测引物对，其特征在于，选自以下8对引物中的任意一对: 引物对1:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6的核苷酸序列组成； 引物对2:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成； 引物对3:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.6的核苷酸序列组成； 引物对4:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成； 引物对5:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7的核苷酸序列组成； 引物对6:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5的核苷酸序列组成； 引物对7:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7的核苷酸序列组成； 引物对8:由SE Q ID N0.10和SEQ ID N0.15的核苷酸序列组成。2.权利要求1所述的特异性PCR检测引物对在检测转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种中应用。3.—种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:⑴提取待检测水稻样品的DNA ；⑵以提取的DNA为模板，以权利要求I所述的特异性PCR检测引物对为扩增上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出目的条带，则待检测的水稻样品是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种；如果从待检测的样品中未能扩增出目的条带，则待检测的水稻样品不是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种。4.一种转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1及其衍生品种的定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取待检测水稻样品的DNA； (2)以提取的DNA为模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.7所示核苷酸为扩增上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增； (3)如果从待检测的样品中扩增出243bp的条带，则待检测的水稻样品是转基因抗虫耐除草剂水稻G6H1或其衍生品种；如果从待检测的样品中未能扩增出243bp的条带，则待检...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊锋，汪小福，陈笑芸，沈志诚，刘慧，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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