本发明专利技术公开了一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，以糖蜜原料，加入乙醇，40KHz超声处理，得糖蜜渣块后，再加入乙醇，20KHz超声处理，并配合N,N-二甲基甲酰胺提取，最终得到含生物素的样品液。本发明专利技术还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法，(1)取待检测样品液，点在硅胶板上，加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点；(3)利用薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，计算出样品液中生物素的质量浓度。具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，以及生物素的检测方法。
技术介绍
生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化、脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动态的物质，是制糖工业上不能再用来煮制糖品的废料，但糖蜜中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加剂，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源。但由于其中生物素的含量与糖蜜的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须密切关注糖蜜的组成变化，准确测定其中的生物素含量，以实现谷氨酸发酵中对生物素用量的控制。现有技术文献报道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法等等。目前，对糖蜜中生物素的检测，微生物法和高效液相色谱法最为常用，但存在以下缺陷:微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。高效液相色谱法投资大、溶剂用量大、成本较高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有杂质较多，故样品处理即生物素的提取纯化过程困难，且高效液相色谱法对样品的纯度要求又较高，对成分复杂、色素含量高、杂质干扰大的糖蜜样品，不宜用该法检测。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，本专利技术还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:以糖蜜为原料提取生物素的方法，步骤如下:(I)取糖蜜10?15g,加入100?150ml的80?95% (体积百分数)乙醇溶液于烧杯中，在40KHz，功率为300?500W，温度60?70°C条件下超声处理20?30分钟，此过程中糖蜜由液体变为块状；超声处理后，取出块状糖蜜，剩余乙醇溶液降温至5°C以下，过滤得残渣；将块状糖蜜与残渣合并，用100?150ml与超声处理同温度、同浓度的乙醇溶液冲洗过滤，得糖蜜渣块；(2)将上述糖蜜渣块加入到100?150ml的95?100% (体积百分数)的乙醇溶液(当为100%时，为无水乙醇)中，在20KHz，300?500W，温度为55?65°C，超声探头深入液面下3cm，间隔5秒超声3分钟设置下连续超声20?30分钟，此过程中，糖蜜块已成黄土色粉状；超声处理后，趁热过滤，得滤液和滤渣，用45?55ml的55?65°C的95?100%(体积百分数)乙醇溶液洗滤渣，得洗液和滤渣，合并滤液和洗液得乙醇滤液，滤渣加入5?8ml的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌提取20分钟，过滤得DMF滤液；(3)将乙醇滤液和DMF滤液合并，得生物素溶液(含有生物素的溶液)，旋转蒸发至2?3ml，作为下述检测的样品液。一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下:(I)取待检测样品液(即上述方法制备得到的生物素溶液)4μ1，点在硅胶板(优选IOcmXlOcm的涂有娃胶GF254高效薄层板)上，加入展开剂，在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内展开,展开剂的饱和时间为60分钟,展开距离为6cm,展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μ I不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，优选3:3:2:0.06 ；所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列标准品溶液；所述生物素标准品溶液的配制方法为:精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液；(2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1?0.2% (质量体积分数，单位g/ml)，硫酸终浓度为I?2% (质量体积分数，单位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点(桔红色)；(3)利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，扫描速度为20mm/s,分辨率为50 μ m/step,得Rf = 0.69 ;照射灯为钨灯，检测计算得到生物素标准品溶液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件winCATSl.4.1计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中生物素的质量浓度。本专利技术的以糖蜜为原料提取生物素的方法，操作简单、可靠，本专利技术的生物素的检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1以糖蜜为原料提取生物素取糖蜜10g，加入80%的乙醇(V/V)溶液IOOml搅拌均匀，放在40KHz，功率为300W，温度为60°C条件下超声30分钟。糖蜜逐渐由液体变成块状，将糖蜜块取出，乙醇溶液速冷至5°C以下后将乙醇溶液倒出得剩余残渣。将糖蜜块和残渣合并，用已准备好的60°C的同浓度的乙醇溶液冲洗，冷至5°C以下倒掉乙醇溶液，得糖蜜渣块。向糖蜜渣块中加入95%乙醇IOOml，在20KHz，300W，温度为55°C，超声探头深入液面下3cm。间隔5秒，超声3分钟设置下连续超声提取30分钟。糖蜜由块状已成土黄色粉状，趁热过滤，得滤液和滤渣，550C，95 %乙醇冲洗滤渣，得洗液，合并滤液和洗液，共得乙醇滤液150ml。滤渣加入二甲基甲酰胺(DMF) 5ml，搅拌提取20分钟。过滤得DMF滤液。将DMF滤液和乙醇滤液合并，经旋转蒸发至液体为2ml，作为样品液。精密称取生物素标准品(Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液。精密吸取50，200, 250，300, 400 μ llmg/ml的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/ μ 1，0.2 μ g/ μ I, 0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液，分别取实施例1所得的样品液4 μ I和标准液4 μ I点在涂有硅胶GF254高效薄层板(IOcmXlOcm)上，以二氯甲烧(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V) =3:3:2:0.06的比例配制8.06ml展开剂,在展开缸(IOcmX 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)取糖蜜10～15g，加入100～150ml的80～95％乙醇溶液于烧杯中，在40KHz，功率为300～500W，温度60～70℃条件下超声处理20～30分钟；超声处理后，取出块状糖蜜，剩余乙醇溶液降温至5℃以下，过滤得残渣；将块状糖蜜与残渣合并，用100～150ml乙醇溶液冲洗过滤，得糖蜜渣块；(2)将上述糖蜜渣块加入到100～150ml的95～100％的乙醇溶液中，在20KHz，300～500W，温度为55～65℃，间隔5秒超声3分钟设置下连续超声20～30分钟；超声处理后，趁热过滤，得滤液和滤渣，用55～65℃的95～100％乙醇溶液洗滤渣，得洗液和滤渣，合并滤液和洗液得乙醇滤液，滤渣加入N,N‑二甲基甲酰胺，搅拌提取，过滤得DMF滤液；(3)将乙醇滤液和DMF滤液合并，得生物素溶液。
【技术特征摘要】
1.一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，其特征在于:步骤如下: (1)取糖蜜10?15g,加入100?150ml的80?95%乙醇溶液于烧杯中，在40KHz,功率为300?500W，温度60?70°C条件下超声处理20?30分钟；超声处理后，取出块状糖蜜，剩余乙醇溶液降温至5°C以下，过滤得残渣；将块状糖蜜与残渣合并，用100?150ml乙醇溶液冲洗过滤，得糖蜜渣块； (2)将上述糖蜜渣块加入到100?150ml的95?100%的乙醇溶液中，在20KHz，300?500W，温度为55?65°C，间隔5秒超声3分钟设置下连续超声20?30分钟；超声处理后，趁热过滤，得滤液和滤渣，用55?65°C的95?100%乙醇溶液洗滤渣，得洗液和滤渣，合并滤液和洗液得乙醇滤液，滤渣加入N，N- 二甲基甲酰胺，搅拌提取，过滤得DMF滤液； (3)将乙醇滤液和DMF滤液合并，得生物素溶液。2.一种生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:步骤如下: (1)取待检测样品液，点在硅胶板上，加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开； 所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，优选3:3:2:0.06 ； 所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05 μ g/μ 1,0.2μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列标准品溶液； ...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘代成，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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