对除草剂具有增强的耐受性的植物制造技术

本发明专利技术涉及控制植物栽培场所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步骤：在该场所提供植物，所述植物至少包含：编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列，和/或编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列；向该场所施用有效量的所述除草剂。本发明专利技术还提供包含mut-HPPD的植物和获得这样的植物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对除草剂具有增强的耐受性的植物专利
本专利技术一般涉及赋予植物对除草剂具有农业水平耐受性的方法。特别地，本专利技术涉及对“香豆酮(coumarone)衍生物”除草剂具有增加的耐受性的植物。更具体地，本专利技术涉及由诱变及杂交育种及转化获得的对“香豆酮衍生物”除草剂具有增加的耐受性的植物和方法。
技术介绍
自20世纪90年代早期以来，抑制异戍二烯基醌(prenylquinones)、质体醌(plastoquinone)和生育酹(tocopherols)的生物合成中的关键酶4_轻苯基丙酮酸双加氧酶(4-HPro;ECl.13.11.27)的除草剂已用于进行选择性杂草控制。其阻断生物合成路径中4_轻苯基丙酮酸转化成尿黑酸(homogentisate) (Matringe等人,2005，Pest ManagSc1.,第 61 卷:269-276 ;Mitchell 等人，2001，Pest Manag Sc1.第 57 卷:120-128)。认为质体醌是类胡萝卜素生物合成中八氢蕃茄红素去饱和酶(phytoene desaturase)的必需辅因子(Boeger 及 Sandmann, 1998, Pestic Outlook,第 9 卷:29-35)。其抑制会使植物质体醌及维生素E库耗尽，从而导致白化症状。类胡萝卜素的损失，特别是其作为对抗光氧化作用的光系统保护剂功能的损失，会导致生长中的枝条组织中叶绿素及光合膜的氧化降解。结果是，叶绿体的合成和功能被破坏(Boeger和Sandmann, 1998)。尿黑酸爺尼基转移酶(homogentisate solanesyl transferase, HST)催化质体醌生物合成路径中HPF1D之后的步骤。HST为异戊二烯基转移酶，其使尿黑酸脱羧并且将来自茄尼基二磷酸酯的茄尼基转移至尿黑酸而由此形成2-甲基-6-茄尼基-1，4-苯醌(MSBQ)，一种质体醌生物合成路径的中间物。HST酶为膜结合酶且编码其的基因包括质体靶向序列。商品化4-HPH)抑制性除草剂的最重要化学类型包括吡唑啉酮类(pyrazolone)、三酮类(triketone)及异續，唑类(isoxazole)。抑制剂通过形成稳定离子偶极电荷转移复合物而模拟底物4-羟苯基丙酮酸与活性位点中的酶结合亚铁离子的结合。在4-HPH)抑制性除草剂中，三酮磺草酮(triketone sulcotrione)为此组除草剂中首个用于农业中的实例且鉴定了其作用机制(Schulz等人，1993，FEBS Lett.第318卷:162-166)。已报导三酮类是纤精酮(Ieptospermone)的衍生物，纤精酮是来自红瓶刷(bottlebrush)植物-红千层属物种(Callistemon spp)-的除草剂成分(Lee等.1997，Weed Sc1.Vol45,162-166)。因为抑制植物中的反应会导致经处理植物的叶变白并且导致所述植物死亡,这些分子中的一些已用作除草剂(PalIett.K.E.等人1997Pestic.Sc1.5083-84)。本领域中描述的以HPPD为靶的除草剂特别有:异唑类(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利号 5，424，276)，特别是异恶唑草酮(isoxafIutole)，其为用于玉米的选择性除草剂；二酮腈类(EP496630、EP496631)，特别地2-氰基-3-环丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙烷 _1，3_ 二丽及 2_ 氛基 _3_ 环丙基-1- (2_S02CH3_4_2, 3C12苯基)丙烷-1，3- 二酮；诸如描述于EP625505、EP625508、美国专利号5，506, 195中的三酮类，特别地磺草酮；*pyrazolinates。此外,众所周知的除草剂苯批唑草酮(topramezone)也在易感植物物种中引发与上文描述的4-HPH)抑制性漂白除草剂同样类型的植物毒性症状，包括生长中的枝条组织中叶绿素丧失和坏死。苯吡唑草酮属于化学种类吡唑啉酮类或苯甲酰基吡唑类且于2006年商业引进。当在萌芽后施用时，该化合物选择性控制玉米中广谱的一年生窄叶杂草和宽叶杂草。植物对“香豆酮衍生物除草剂”的耐受性也已在许多专利中加以报导。国际申请号TO2010/029311 —般地描述HPTO核酸及/或HST核酸在植物中引发除草剂耐受性的用途。W02009/090401、W02009/090402、W02008/071918、W02008/009908 具体公开了某些“香豆酮衍生物除草剂”及“香豆酮衍生物除草剂”耐受性的植物株系。3种主要策略可用于使植物耐受除草剂，亦即(I)用将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物的酶去除除草剂毒性，诸如用于溴苯腈(bromoxynil)耐受性或草铵膦(basta)耐受性的酶(EP242236、EP337899) ； (2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代谢物敏感性较小的功能性酶，诸如用于草甘膦(glyphosate)耐受性的酶(EP293356、PadgetteS.R.等人，J.Biol.Chem., 266, 33, 1991);或(3)过表达敏感性酶，使得鉴于此酶的动力学常数，在植物中生产相对于除草剂足够的靶酶量，以致尽管存在其抑制剂，仍有足够的功能性酶可用。已经描述了第三种策略用于成功获得对HPH)抑制剂具有耐受性的植物(W096/38567)。US2009/0172831公开了编码具有酶促活性的氨基酸序列的核苷酸序列，使得该氨基酸序列对HPH)抑制剂除草剂化学品具有抗性，特别是三酮抑制剂特异的HPH)突变体。迄今为止，现有技术尚未描述含有至少一个突变的HPro核酸的香豆酮衍生物除草剂耐受性植物。现有技术亦尚未描述在除从中获得HPro基因的基因组以外的基因组中含有突变的香豆酮衍生物除草剂耐受性作物。因此，本领域需要自其它基因组及物种鉴定香豆酮衍生物除草剂耐受基因。本领域亦需要对除草剂例如香豆酮衍生物除草剂具有增强的耐受性且含有至少一个突变的HPro核酸的作物。亦需要控制此类作物或其附近杂草生长的方法。当向包含作物的区域施用除草剂时，这些组合物及方法允许使用喷药技术。专利技术概述本专利技术解决了该技术问题，本专利技术涉及控制植物栽培场所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步骤:a)在该场所提供包含至少一个如下核酸的植物，所述核酸包含:(i)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPH))的核苷酸序列，和/或(ii)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列，b)向该场所施用有效量的所述除草剂。此外，本专利技术涉及:通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 或其变体的核酸编码的mut-HPPD，和/或通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO:47或49或其变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
控制植物栽培场所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步骤：a)在该场所提供包含至少一个核酸的植物，其中所述核酸包含：(i)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut‑HPPD)的核苷酸序列，和/或(ii)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut‑HST)的核苷酸序列，b)向该场所施用有效量的所述除草剂，其中所述香豆酮衍生物除草剂包含具有选自表2式1、2、3和4的通式的化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.02 EP 11187487.1;2011.11.04 EP 11187887.2;1.控制植物栽培场所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步骤: a)在该场所提供包含至少一个核酸的植物，其中所述核酸包含: (i)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPro)的核苷酸序列，和/或 (?)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列， b)向该场所施用有效量的所述除草剂， 其中所述香豆酮衍生物除草剂包含具有选自表2式1、2、3和4的通式的化合物。2.根据权利要求1的方法，其中⑴的核苷酸序列包含SEQID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 的序列、或其变体或衍生物。3.根据权利要求1的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含SEQID NO:47或49的序列、或其变体或衍生物。4.根据权利要求1至3之任一的方法，其中植物包含至少一个另外的异源核酸，所述核酸包含(iii)编码除草剂耐受酶的核苷酸序列。5.根据权利要求1至4之任一的方法，其中香豆酮衍生物除草剂组合一种或多种其它HPPD和/或HST靶向除草剂一起施用。6.鉴定香豆酮衍生物除草剂的方法，所述方法通过使用由包含核苷酸序列SEQID NO:1, 51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HPPD、和/或使用由包含核苷酸序列SEQ IDNO:47或49或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HST来进行，其中所述香豆酮衍生物除草剂包含具有选自表2式1、2、3和4的通式的化合物。7.根据权利要求6的方法，其包含以下步骤: a)生成包含编码mut-HPH)的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-HPH)； b)对a)的转基因细胞或植物和对相同品种的对照细胞或植物施用香豆酮衍生物； c)测定施用所述测试化合物之后转基因细胞或植物及该对照细胞或植物的生长或生存力，及 d)选择使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低的测试化合物。8.鉴定编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-HPH)的核苷酸序列的方法，该方法包括: a)生成mut-HPH)编码核酸的文库， b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸且用香豆酮衍生物处理所述细胞或植物，筛选所得mut-HPro编码核酸的群体， c)比较由所述mut-HPH)编码核酸群体提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平与由对照HPPD编码核酸提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平， d)选择至少一种mut-HPH)编码核酸，较之对照HPH)编码核酸，其提供对“香豆酮衍生物”的显著增加的耐受性水平， 其中所述香豆酮衍生物除草剂包含具有选自表2式1、2、3和4的通式的化合物。9.根据权利要求8的方法，其中较之由对照HPH)编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性，步骤d)中选出的mut-HPH)编码核酸提供至少2倍的香豆酮衍生物除草剂耐受性。10.根据权利要求8或9的方法，其中抗性或耐受性通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物和比较所述转基因植物与对照植物而测定。11.编码mut-HPPD的分离的核酸，所述核酸包含SEQID NO: 2, 5，8，11，14，17，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，53，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，48，50、或其变体或衍生物。12.权利要求11的分离的核酸，其中核酸可以通过权利要求8至10之任一中定义的方法鉴定。13.转化了野生型或mut-HPH)核酸的转基因植物细胞，其中较之野生型品种的植物细胞，所述核酸在植物细胞中的表达导致对香豆酮衍生物除草剂增强的抗性或耐受性，其中所述香豆酮衍生物除草剂包含具有选自表2式1、2、3和4的通式的化合物，其中野生型或mut-HPPD核酸包含选自以下的多核苷酸序列:a)如SEQ ID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 中所示的多核苷酸、或其变体或衍生物山)如SEQ ID NO:47或49中所示的多核苷酸、或其变体或衍生物；c)编码如 SEQ ID NO:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·赫茨勒，S·特雷施，T·米茨纳，M·维切尔，J·莱尔希尔，R·阿朋特，L·帕尔拉帕多，J·M·保利克，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE