本发明专利技术涉及一种用于生物组织中的内源性荧光团的检测、量化和/或可视化的方法,所述方法包括以下步骤:a)在多光子激发之后,采集一组连续的三维图像或二维图像,该图像提供关于样本中的荧光信号随时间减弱的信息;b)通过对所述荧光信号的对数进行线性回归来处理这些图像,确定所述线性回归的斜率在所述样本中的空间分布;和c)至少基于这种空间分布,生成关于荧光团在所述样本中的存在和/或体积密度或表面密度的信息,所述荧光团为黑色素。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物组织内如黑色素的内源性荧光团的特异性3D检测、可视化和/或量化的非侵入性方法
本专利技术涉及生物组织、尤其是诸如皮肤的角蛋白材料的观测。本专利技术更具体地但不仅仅涉及旨在确定生物组织中的黑色素的分布、尤其是分布的数量和/或性质,尤其是为了评估美容处理或治疗处理的作用。
技术介绍
生物组织的颜色与黑色素的数量和三维分布有紧密的关系。如今,以二维形式,通过在组织学切片上利用FontanaMasson染色的黑色素的白光成像和定量,或者以三维形式,在图像处理之后,通过黑色素的多光子成像和三维定量,能够进行表征黑色素的数量和分布。多光子显微镜检查促进生物组织、尤其是高度散射的活的组织的深入观测。这是因为由于红外光被较少散射且被较少吸收,故红外光更好地透入到组织中,并且利用非线性机制来产生信号在散射介质中引入了更强的信号选择标准。这种非线性机制涉及两种或甚至更多种光子与期望检测的分子或结构的同时相互作用。通常,激发光束被聚焦且扫描在样品中,检测所形成的非线性信号,以便获得图像。由于具有激发功率的信号的非限制性依赖,这种类型的成像的特殊性是基于所提供的光学切片性能。由于激发功率密度在焦点处是非常高的,故所考虑的非线性效应仅有效地出现在有限的聚焦体积中;这种基本性能确保了在样品中所获得的信号的控制,因此可以获得固有的大约微米的三维分辨率。成像深度根据组织而变化,对于人类皮肤,成像深度大约可以是130μm至200μm。此外,由于使用内源性信号源,这种成像技术不需要标记组织成分。通过内源性生色团,形成荧光信号;除了黑色素,可以提及NAD(P)H(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、黄素、角蛋白和弹性蛋白。申请FR2944425公开了一种通过多光子显微镜检查评估皮肤色素沉着的方法,该方法基于在皮肤中、在表皮的基底层的水平,通过比其他的内源性荧光团更强的荧光强度来反映高度集中的黑色素。具有高强度的像素归因于黑色素。然而,这种方法不总是令人满意的,这是因为,首先,该方法可被其他的也显示出高荧光强度的荧光团(如,角蛋白)所扰乱,其次,该方法未考虑到具有可与其他内源性荧光团相提并论的荧光信号的黑色素。更加特异性的方法包括考虑黑色素的荧光寿命。的确,黑色素的荧光寿命取决于黑色素的固有荧光性质,不取决于荧光强度和在激发体积中的荧光团浓度。黑色素具有双光子激发荧光寿命,该荧光寿命不同于其他内源性荧光团的荧光寿命。根据通过FLIM(荧光寿命成像)所获得的图像,可以估计这种荧光寿命,该FLIM为在M.S.Roberts等人的文章“Non-invasiveimagingofskinphysiologyandpercutaneouspenetrationusingfluorescencespectralandlifetimeimagingwithmultiphotonandconfocalmicroscopy”(EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics,2011年第77卷,第469页至第488页)中所描述的、包括监控荧光信号随时间减小的一种技术。申请JP2009-142597描述了一种用于可视化黑色素的方法,该方法将多光子显微镜检查和FLIM相结合。为了提供荧光寿命的良好估计,FLIM技术需要在时间和空间上的荧光信号的积分、在时间方面是昂贵的操作,从而限制了这种技术尤其在三维成像背景下的应用的可能性。
技术实现思路
因此,需要受益于灵敏的、非侵入性的方法,对于生物组织中的黑色素的分布的三维可视化,该方法易于实施,可以获得可靠的、快速的、有重要性的结果。本专利技术的目的是发展一种比现有技术方法更简单更快速的方法,该方法可以特异性地检测黑色素,并且可以表征其在生物组织、尤其在表皮中的三维分布。还需要可以验证在处理期间使用的,例如基于抗色素沉着活性剂、脱色活性剂或促进色素沉着活性剂的产品的功效或无害性。在表征尤其是皮肤的色素沉着方面还存在优势,以便使黑色素根据皮肤类型、种群、地理位置、或者饮食等的数量和分布的差异具体化,并且以便表征尤其是皮肤的色素沉着症,如光化性着色斑(actiniclentigenes)、斑点(雀斑)、或黄褐斑(在怀孕期间有时出现的斑)。此外,在探求在合成的方式上重建开发新的组织的背景下,需要使黑色素根据组织模型、尤其是皮肤模型的类型的数量和分布的差异具体化。本专利技术目的在于满足所有或部分这些需要。因此,根据本专利技术的一个方面,本专利技术的主题是一种用于生物组织内的内源性荧光团成分如黑色素的检测、量化和/或可视化的方法,该方法包括以下步骤:a)在多光子激发之后,采集一组连续的提供关于样本中的荧光信号随时间减弱的信息的三维图像或二维图像,b)通过对所述荧光信号的对数进行线性回归来处理这些图像,确定所述线性回归的斜率在所述样本中的空间分布,和c)至少根据这种三维空间分布,生成关于荧光团在所述样本中的存在和/或量的信息。该方法是非侵入性的,可被用在非治疗的、美容的情况下。该方法可以评估色素沉着。所采集的图像为三维时间图像。术语“三维时间图像”用于指随时间的一系列连续的三维图像。每个三维图像对应一叠代表在给定时刻和给定深度的样本的结构的二维图像。每个三维图像或二维图像的每个像素可由空间坐标(x,y,z)限定,z为在样本中的深度。因此,每个二维图像对应三维图像的一种特殊情况,其中,仅仅在给定深度z处进行采集。三维图像的像素被一起群集到在各个时刻采集的图像的具有相同的空间坐标的像素集合中,这些集合中的每一个被称为“时间像素”。通过在一定时间段中对双光子激发的荧光信号积分,可以获得每个像素的荧光信号的值。特别地,以规律的间隔,尤其是在1ns和3ns之间(例如,等于1ns、1.5ns、2ns、2.5ns或3ns)的时间段内,可进行荧光信号的积分。通过对荧光寿命的对数的线性回归,可以获得荧光信号减弱的斜率。该方法可需要仅采集有限数量的三维时间图像,例如,三个和五个之间,这在采集时间和精确度之间提供了良好的折衷。通过对数的线性回归所获得的斜率的利用促进了采集的数量的该限制。与FLIM技术相比,本专利技术降低了时间采集的数量,使该方法更加容易且更加快速地实施。虽然FLIM技术允许更好地估计荧光寿命,但随着三维图像的分辨率的降低,需要相当长的采集时间(大约30s),根据本专利技术的方法对于获得三维可视化或量化是更加快速的且特别有利的,而同时保持相当于显微镜的理论分辨率的分辨率。对于给定样本的坐标(x,y,z)的时间像素总的采集时间大约为0.28μs,而不是FLIM中的几毫秒(ms)。例如,对于每个时间像素的时间采集的数量等于四,并且,对于每个像素,双光子激发的荧光信号在两个采集之间的时间内,尤其通过2ns的定期间隔,而被积分。根据本专利技术的方法可被活体实施,也可以对活体外(exvivo)的和离体的样本实施该方法。本专利技术提高了采集方法和图像处理方法的快速性。凭借本专利技术,组织的3D表征是可行的,且允许高通量的活体应用。组织可包括人类角蛋白材料。术语“角蛋白材料”尤其用于指头发、睫毛、眉毛、皮肤、指甲、黏膜、头皮。根据本专利技术的生物组织,尤其是角蛋白材料可以是天然的或人造的;样本例如是人类皮肤或重建的或人造的皮肤。生物组织可以是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生物组织中的内源性荧光团的检测、量化和/或可视化的方法,所述方法包括以下步骤:a)在多光子激发之后,采集一组连续的三维图像或二维图像,所述三维图像或二维图像提供关于样本中的荧光信号随时间减弱的信息;b)通过对所述荧光信号的对数进行线性回归来处理这些图像,确定所述线性回归的斜率在所述样本中的空间分布;和c)至少基于该空间分布,生成关于荧光团在所述样本中的存在和/或体积密度或表面密度的信息,所述荧光团为黑色素。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.08 FR 11601721.一种用于生物组织中的内源性荧光团的检测、量化和/或可视化的方法,所述方法包括以下步骤:a)在多光子激发之后,采集一组连续的三维图像或二维图像,所述三维图像或二维图像提供关于样本中的荧光信号随时间减弱的信息;b)通过计算所述荧光信号的对数以及对所述荧光信号的对数进行线性回归来处理这些图像,确定所述线性回归的斜率在所述样本中的空间分布;和c)至少基于该空间分布,生成关于荧光团在所述样本中的存在和/或体积密度或表面密度的信息,所述荧光团为黑色素。2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述一组图像包括在三个图像和五个图像之间。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,以规律的间隔对所述荧光信号进行积分。4.根据权利要求3所述的方法,其中,在1ns和3ns之间的时段内对所述荧光信号进行积分。5.根据权利要求1所述的方法,其中,在已消除具有低值斜率的像素之后,生成步骤c)的所述信息。6.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤c)的所述信息以所述黑色素的空间分布的至少一种表示的形式而生成。7.根据权利要求1所述的方法,其中,所生成的信息提供关于在所述组织中由黑色素所占据的表面和/或体积的信息。8.根据权利要求1所述的方法,其中,对生物...
【专利技术属性】
技术研发人员:特蕾泽·巴尔德卫克,安娜玛丽亚·潘纳,艾曼纽·坦克雷德博安,艾蒂安·戴西恩赛雷,瑟奇·库都罗,
申请(专利权)人:欧莱雅,
类型:发明
国别省市:法国;FR
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