无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用。本发明专利技术提供的无乳链球菌BibA重组蛋白，是具有如序列2所示的蛋白序列，同时，还提供了该蛋白的编码基因及制备方法和应用。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术以无乳链球菌为研究对象，从无乳链球菌DNA中克隆到BibA基因，完成了该基因序列的克隆及测序，并对其进行原核表达与免疫保护性的研究，获得特异性高、有免疫保护力的疫苗研制候选抗原，为无乳链球菌病的预防奠定基础。本发明专利技术的优点在于克隆到了无乳链球菌BibA基因，构建了BibA重组表达质粒，获得了BibA重组蛋白，经westernblot检测结果显示BibA重组蛋白具有较好的反应原性，动物（小鼠）实验证明该重组蛋白具有一定的保护性。

【技术实现步骤摘要】
无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程领域中的无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用。
技术介绍
无乳链球菌是一种人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、兔、罗非鱼、牛蛙等多种脊椎动物，人体医学上将无乳链球菌称为B群链球菌(GBS)。GBS能使带菌孕妇引发早产、晚期流产、胎儿发育不良、胎膜早破、子宫内膜炎、泌尿道感染等；无乳链球菌在奶牛上可引起奶牛的急性、亚急性和慢性乳房炎。目前无乳链球菌可分为10个血清型，临床研究表明，该菌存在耐药性逐年增强的趋势，所以疫苗预防该病成为科研工作者的首要目标。但目前研制无乳链球菌常规疫苗存在许多技术难点:1)无乳链球菌菌体灭活疫苗免疫保护效果有差异；2)血清型众多，不同血清型菌株之间交叉保护性差；3)目前已知的保护性抗原较少。因此，筛选和获得无乳链球菌的候选免疫蛋白成为研制奶牛乳房炎高效疫苗的关键技术问题。目前尚无关于无乳链球菌BibA蛋白用于疫苗候选蛋白的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了可作为无乳链球菌基因工程疫苗候选蛋白的无乳链球菌BibA重组蛋白。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:无乳链球菌BibA重组蛋白，具有如序列2所不的蛋白序列。本专利技术的第二个目的是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因。进一步的，上述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因，是如下a)或b)的基因: a)其核苷酸序列是序列表中的序列I; b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述无乳链球菌BibA重组蛋白的DNA分子。本专利技术的第三个目的，是提供了含有上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒为pCold? I DNA-BibA0本专利技术的第四个目的，是提供了含有上述重组表达质粒的工程菌，所述工程菌为pCold? 1-BibA/BL21(DE3)。上述一种无乳链球菌BibA重组蛋白的制备方法，包括有以下步骤: O获得如上所述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因； 2)将步骤I)得到的无乳链球菌BibA重组蛋白克隆入表达载体pCold?I DNA中，得到pCold? 1-BibA重组质粒；3)将步骤2)得到的pCold?1-BibA重组质粒导入宿主细胞疋coli BL21-DE3 ； 4)诱导表达得到无乳链球菌BibA重组蛋白。本专利技术的第五个目的，是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白作为基因工程疫苗研制过程中的候选蛋白的应用。具体操作步骤为: (1)设计引物: 设计的BibA基因的表达引物对为: 上游引物 BibAl: 5’ -CGCGGA7TCTCGGATTCAATTCCTCAT-3’ (斜体下划线为汉.Η I 酶切位点)， 下游引物 BibA2: 5’ -CGGMTTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-S'(斜体下划线为 &oR I酶切位点)； (2)BibA基因的扩增与获得: 以提取的无乳链球菌基因组DNA为模板进行BibA基因的PCR扩增，反应体系为 50.0μ L:DNA 模板 6.0μ L，上下游引物各 1.0μ L , Premix Ex Taq 25.0 μ L，ddH2017.0μ L ;PCR 反应条件为:95°C 预变性 5 min、95°C 变性 I min、64°C 复性 I min、72°C 延伸 Imin,反应30个循环；72°C延伸10 min ； (3)重组表达质粒的构建:将目的基因以“T-A”连接的原理克隆入载体T-VectorPMD20，转化到E.coli DH5 α感受态细胞中，并进行阳性重组质粒双酶切和测序鉴定，将测序正确的阳性重组质粒pMD20-T-BibA和表达载体pCold? I DNA用汉.Η I和&oR I分别双酶切，纯化酶切产物，T4 DNA连接酶4°C过夜连接，将连接物转化入疋co/i BL21 (DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单个菌落，接种于含6mL LB/AMP液体培养基的IOmL离心管中，37°C振荡200rpm/min培养12 h，提取质粒，经I和&oR I双酶切和测序鉴定为阳性的为阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA ； (4)重组表达质粒pCoId?1-BibA在宿主细胞万.coli BL21(DE3)中的表达: 取pCold? 1-BibA/BL21(DE3)工程菌接种于LB液体培养基中，于37°C振荡培养至OD6qci 达到 0.5 时，分别加入 IPTG 至终浓度为 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8mmol/L及1.0m mol/L，在其它条件不变的前提下，分别在16°C、28°C、32°C、37°C和42°C等不同温度诱导表达；同样以 IPTG 终浓度为 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8m mol/L及1.0m mol/L进行诱导表达；收集诱导后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及过夜表达菌液，最后通过SDS-PAG E鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件与表达产物的可溶性； (5)Western blot 方法检测: 根据上述(4)确定的最佳诱导条件，将不含阳性重组表达质粒的万BL21(DE3)菌体蛋白和含有阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA的工程菌pCold? 1-BibA/BL21(DE3)进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维膜上，用小鼠抗6个组氨酸单抗作为一抗、辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG为二抗，进行Western blot分析； (6)重组蛋白的纯化与复性: 根据上述(4)确定的最佳表达条件，诱导表达IL含阳性表达质粒pCold? 1- BibA的工程菌菌液，4°C 5000 g离心10min，弃上清，沉淀用细胞裂解液重悬，超声破碎后，4°C，13000g离心10min，收集沉淀。采用包涵体纯化试剂盒纯化重组BibA蛋白，并经SDS-PAGE分析。将纯化的蛋白溶液加入透析袋中，透析袋在放入10倍体积的5mol/L尿素中4°C透析6_8h，换用2.5mol/L尿素4°C透析6-8h，再用PBS在4°C透析过夜，采用BCA法测定蛋白浓度； (7)对BibA进行免疫效果的初步研究: 将60只健康昆明小鼠随机分为3组，分别为BibA重组蛋白免疫组(20只)、佐剂对照组(20只)和感染对照组(20只);BibA重组蛋白免疫组的处理方式为:BibA重组蛋白和弗氏完全佐剂按I: I乳化后，每只小鼠免疫注射0.2mL,然后用BibA重组蛋白和弗氏不完全佐剂按1:1乳化后，在首次免疫7d和14d后每只小鼠再各免疫注射0.2 mL ;佐剂对照组的处理方式为:用PBS代替抗原与弗氏佐剂乳化进行免疫注射，免疫方法和免疫剂量与BibA重组蛋白免疫组类似；感染对照组用PBS代替免疫原进行免疫注射；各组均进行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻击感染，每只小鼠经腹腔注射无乳链球菌进行感染，观察小鼠发病情况，并计算保护率。本专利技术的有益效果为: 本专利技术以无乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
无乳链球菌BibA重组蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。

【技术特征摘要】
1.无乳链球菌BibA重组蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。2.无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因，其特征在于:是如下a)或b)的基因: a)其核苷酸序列是序列表中的序列I; b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述无乳链球菌BibA重组蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭荣，李建喜，杨志强，王学智，常瑞祥，王磊，张景艳，秦哲，孔晓军，孟嘉仁，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62