本发明专利技术公开了一种基因组DNA提取方法及试剂盒，该试剂盒包含研磨器、溶液A（裂解液）、溶液B（DNA结合液）、溶液C（DNA洗涤液）、溶液D（DNA洗脱液）和纯化柱。该发明专利技术的试剂盒，成本低廉，试剂成分简单，操作流程少，不仅适用于微生物基因组的提取而且还适用于动物组织和植物组织的基因组的提取。同时提取基因组的过程耗时短（30min以内），提取的基因组质量高，基因组条带大小约为23kb，基因组的量可稳定保持在1μg-30μg的范围内；提取的过程不会用到有毒的试剂苯酚、氯仿，能很好的满足SouthernBlot，PCR，RFLP，DNA文库构建等各种分子生物学实验。
【技术实现步骤摘要】
—种基因组DNA提取方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及基因组DNA提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
自PCR扩增技术专利技术以来，生物分子学的研究突飞猛进。对基因的研究己经遍及医疗健康、农业生产、环境保护及生物各学科领域。基因组DNA的提取是分子生物学研究的前提，在上述各领域中广泛应用。提取基因组DNA常用的方法是用物理方法破壁，例如液氮研磨和高温加热；或者是酶解，例如溶菌酶酶解；或者非离子表面活性剂处理例如，CTAB法(Walker WH等，1991)氯化苄法和SDS法(林福呈和王洪凯，2010)，细胞破壁和破膜后利用有机溶剂使用苯酚、氯仿、异戊醇的混合溶液使蛋白质变性达到与DNA分离的目的。虽然这些方法能够提取出高质量的基因组DNA，但是提取过程中的这些有机溶剂对人体皮肤、呼吸道粘膜、眼睛等有较大的伤害，而且提取的基因组常有有机溶剂残留，使得后面的实验结果不稳定；后来又出现了利用DNA吸附材料来达到蛋白质与DNA分离的目的，同时也开发了很多试剂盒来提取不同材料的基因组，虽然提取的基因组质量很高但成本较高、通用性不强。但是不论是使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提还是使用DNA提取试剂盒来提取基因组，样品的预处理始终是一个繁琐和耗时的过程。革兰氏阳性细菌和酵母菌细胞壁非常坚实，常见的提取基因组方法中都会加入溶菌酶消化细胞壁。对于人类和动物组织，需要加入蛋白酶K过夜处理使组织更分散。对于植物组织和丝状真菌菌丝或者是真菌孢子，需要使用液氮研磨破壁。
技术实现思路
为了克 服上述问题，本专利技术提供了一种快速基因组DNA提取试剂盒及其制备方法，该方法可以针对绝大多数生物样品，操作简单、经济、无毒无污染，高质高效。一种基因组DNA提取试剂盒，包括溶液A (裂解液)、溶液B (DNA结合液)、溶液C(DNA洗涤液)和溶液D (DNA洗脱液)；溶液A(裂解液):10mM-50mM Tris-HCl pH8.0,10mM-50mM EDTA, 1%-10% (w/v)SDS,2M-4M NaCl，0.5%-2% (v/v)的 β -巯基乙醇；溶液B (DNA结合液):2.5-6M的盐酸胍或者异硫氰酸胍，20%_40% (v/v)异丙醇或者是无水乙醇，5mM-20mM EDTA, pH4.5-6.5 ；溶液C (DNA 洗涤液):70%-80% (v/v)的无水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ；溶液D (DNA洗脱液):5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液将pH调到7.0-8.5 ο还包括研磨器:该研磨器可以为电动组织研磨器或者小型的手提电钻其转速800-12000rpm,配有长度为40-80mm,直径3_7mm的锥形研磨件。上述试剂盒的优选配方溶液A:50mM Tris_HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β _ 巯基乙醇，ρΗ8.0 ；溶液B:4M的盐酸胍、20%异丙醇、IOmM EDTA, pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；溶液C:70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液将pH调到8.0。研磨器:转速8000rpm、配有长度为70mm,直径5mm的锥形研磨件。本专利技术的主要原理:研磨器在高速条件下产生的剪切力不仅能将丝状真菌的细胞壁破碎，同时研磨杵与离心管壁的摩擦作用而产生较高的温度(500C -700C )，有利于SDS裂解细胞。在研磨器、高温和SDS的相互作用下，丝状真菌的基因组DNA释放出来。在2MNaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金属螯合剂能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。DNA结合液提供一个高盐低PH值的环境，在这种条件下，DNA可以与硅胶柱可逆结合。洗涤液是70%乙醇可以对硅胶柱脱盐。DNA在pH7.0-8.5的低盐溶液中，具有最大洗脱效率。洗脱液是含有RNA酶的碱性水溶液，能将硅胶柱上DNA洗脱下来。本专利技术的另一方面是使用该试剂盒提取基因组DNA的方法，包括以下步骤:1、样品的预处理(I)取1.5mL的锥底离心管，加入0.1mg-1OOmg组织样品或者IO6-1O9细胞样品；(2)向(I)中加入 50 μ L-100 μ L 的溶液 A ;(3)开动研磨器研磨样品30s_5min ；2、样品的过柱纯化(4)向研磨好的菌丝中加入溶液A使样品终体积在150 μ L左右；(5)漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；(6)离心机转速 10000g_12000g,离心 5min ；(7)小心取上清100 μ L至一新的1.5mL离心管中，加入300 μ L-600 μ L的溶液B，上下颠倒混匀；(8)将(7)的混合液加入纯化柱中，10000g_12000g，离心30s_lmin ；(9)弃收集管中的液体，向纯化柱中加入300 μ L-600 μ L的溶液B，10000g_12000g,离心 30s_lmin ；(10)弃收集管中的液体，向纯化柱中加入500 μ L-700 μ L的溶液C，10000g_12000g,离心 30s_lmin ；(11)重复(10);(12)弃收集管中的液体，10000g-12000g，离心 2_5min ；(13)将(12)的纯化柱转移到一新的1.5mL离心管中，加入30-50 μ L的溶液D，37°C 放置 5min ；(14) 10000g-12000g,离心 l_2min ；(15) _20°C保存提取的基因组DNA溶液。本专利技术提取 样本的对象可以是培养细胞(动物细胞或人类细胞)或细菌(革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)或酵母菌等单细胞、人类及动物组织或者是植物组织或者是大型真菌组织、血液或骨髓、丝状真菌(米曲霉、黑曲霉等)、真菌孢子(米曲霉孢子、黑曲霉孢子、灵芝孢子等)。但处理的样本不同，裂解处理的步骤有所不同。a、对于样本为培养细胞(动物细胞或人类细胞)或细菌(革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)或酵母菌等单细胞:所述样品预处理步骤为:取ImL浓度≥ 1.0X 106/mL的细胞，在转速≥5000rpm的离心机中离心5min收集细胞，加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min。b、对于样本为人类及动物组织或者是植物组织或者是大型真菌组织,例如,蘑菇、木耳等；所述预处理步骤为:将样本剪碎或者是磨碎，转移到1.5mL的离心管中，样品量控制在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨3_5min。C、对于样本为血液或骨髓；所述预处理步骤为:取ImL血液,在转速≥5000rpm的离心机中离心5min收集细胞,加入50 μ L-100 μ L的裂解液,并用研磨器研磨l_2min。d、对于样本为丝状真菌，例如米曲霉、黑曲霉等。对于生长在固体培养基上的菌丝可以用牙签或者移液器枪头挑取；对于生长在液体培养基中菌丝可以用转速≥1000Orpm的离心机中离心10min或者是过滤收集菌丝。菌丝量在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和纯化柱；溶液A：10mM‑50mM Tris‑HCl，10mM‑50mM EDTA，1%‑10%w/v SDS，2M‑4M NaCl，0.5%‑2%v/vβ‑巯基乙醇，pH7.5‑8.5；溶液B：2.5‑6M的盐酸胍或异硫氰酸胍，20%‑50%v/v异丙醇或是无水乙醇，5mM‑20mM EDTA，pH4.5‑6.5；溶液C：70%‑80%v/v的无水乙醇，pH4.5‑6.5；溶液D：5‑50μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液调pH至7.0‑8.5。
【技术特征摘要】
1.一种基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和纯化柱； 溶液 A:10mM-50mM Tris-HCl,10mM-50mM EDTA,1%-10%w/v SDS，2M_4M NaCl,0.5%-2%v/v β -巯基乙醇，ρΗ7.5-8.5 ； 溶液B:2.5-6M的盐酸胍或异硫氰酸胍，20%-50%v/v异丙醇或是无水乙醇，5mM-20mMEDTA, ρΗ4.5-6.5 ； 溶液 C:70%-80%v/v 的无水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ； 溶液D:5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液调pH至7.0-8.5。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括研磨器，该研磨器可以为电动组织研磨器或者小型的手提电钻其转速800-12000rpm，配有长度为40_80mm，直径3_7mm的锥形研磨杵。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述研磨器的转速1500-8000rpm、并配有长度70mm,直径5mm的锥形研磨件。4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于， 溶液 A:50mM Tris-HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β -巯基乙醇，ρΗ8.0 ； 溶液B:4Μ的盐酸胍、20%异丙醇、IOmM EDTA, ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸钠缓冲液； 溶液C:70%的无水乙醇、ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸钠缓冲液； 溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用lmol/L NaOH溶液将pH调到8.0。5.一种基因组DNA提取方法，其特征在于，利用权利要求1~4任意一项所述的试剂盒进行提取，具体包含以下步骤: (1)取L5mL的锥底离心管，加入0.1mg-1OOmg组织样本或者IO6-1O9细胞样本与50 μ L-100 μ L的溶液A混合；开动研磨器研磨样本30s-5m...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，周斌，王斌，何攀，吕扬勇，廖瑜玲，李秀鹏，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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