一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法技术

本发明专利技术公开了一种评估废水中抗生素的综合生物效能（效价当量）的方法，包括对废水采用比浊法测定吸光度，计算废水中抗生素的残留生物效能。本发明专利技术方法能够对废水中的不同抗生素及其具有抗菌活性基团的代谢产物进行准确测定，操作简便，从而能够对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价，而且对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种评估废水中抗生素的综合生物效能（效价当量）的方法，包括对废水采用比浊法测定吸光度，计算废水中抗生素的残留生物效能。本专利技术方法能够对废水中的不同抗生素及其具有抗菌活性基团的代谢产物进行准确测定，操作简便，从而能够对不同类型抗生素废水进行比较或是对含有多种抗生素的混合废水进行综合评价，而且对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性。【专利说明】
本专利技术属于抗生素的检测领域，特别涉及抗生素生产废水中残留抗生素及其相关物质的生物效能的评估方法。
技术介绍
抗生素的污染问题受到越来越多的重视,抗生素已经成为环境中普遍存在的污染物，不仅在土壤和地表水中被频繁检出，在地下水甚至饮用水源中也有发现。其中，抗生素生产废水是抗生素进入环境的重要来源之一。1995年Holm等人分析了一个废弃制药厂废物填埋场的地下水，结果磺胺类药物浓度达到5mg/L ；2008年我国一个调查发现土霉素生产废水经过处理后出水土霉素浓度达到50mg/L。抗生素生产废水中残留抗生素及相关物质(主要是某些具有抑菌效应的异构体或水解与降解中间产物等)含量高，对废水生物处理系统的影响也相当显著。因此抗生素生产废水的研究受到广泛的关注。目前国内外对废水中抗生素的检测主要采用的是色谱法及其联用技术、毛细管电泳法等理化检测方法。理化检测方法是利用抗生素分子中的官能团所具有的特殊反应或由其性质来测定含量，使用最广泛的是相对成熟的液相色谱法及其联用技术。但是此方法适用于已知结构的抗生素及其代谢产物，需要有相应的抗生素标准品才能进行定量，而抗生素生产废水在处理过程中会发生一系列的变化，产生不同的异构体或水解与降解中间产物，这些产物中仍有部分会保留一定的抗菌活性甚至可能具有更高的抗菌活性，例如，土霉素在弱酸条件下(pH值3-6.5)，土霉素能够降解成为去水土霉素(Anhydrooxytetracycline)和差向异构土霉素(Epimeric-Oxytetracycline),去水土霉素能够迅速不可逆地降解成为a-Apo-OTC和β-Αρο-OTC，强酸条件下，a-Apo-OTC和β -Apo-OTC能够进一步不可逆降解成为Ter-OTC ;同时在较温和的中性和弱碱条件下，土霉素可能产生更为复杂的降解过程，形成iso-OTC，N-DM-OTC，以及N-DDM-OTC等降解产物；在碱性溶液中，土霉素的主要降解产物是Terranoic acid。差向异构土霉素、a-Apo-OTC和β-Apo-OTC往往是土霉素的主要降解产物，而差向异构土霉素与土霉素的比例在0.4到0.6之间。这三种主要的降解产物仍然具有部分抗菌作用，最低抑菌浓度(MIC)分别为1.0、32和>32mg/L，同时也有实验表明这三种降解产物的生物毒性超过土霉素的生物毒性。例如申请号为200810110955.7的专利技术专利申请公开了一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法。该方法利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定四环素类抗生素残留量。试样经Na2EDTA-McIIvaine缓冲液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，经HLB固相提取小柱净化和富集，采用色谱柱分离，以标准品土霉素、四环素和金霉素配制含量为 100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、lng/ml、0.lng/ml、Ong/ml 的标准溶液，在柱温30°C，以含有0.1%甲酸的水溶液(v/v)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量。此法虽然快速、准确、灵敏度高，但是其适用范围仅用于测定土霉素、四环素和金霉素三种四环素类抗生素的含量，对于其中可能出现的其他类抗生素以及相关的代谢中间产物则不能进行检测。本专利技术主要针对此问题，以抗生素中具有抑菌活性的有效成分即“效价”作为对象，检测废水中抗生素的残留生物效能(抗生素及其相关物质的生物效能)。根据药典，抗生素效价常采用微生物检定法，是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理，如管碟法、比浊法、稀释法等，其中，管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和待检品两者对试验菌的抑菌圈的大小来测定供试品的效价。2005年版《中国药典》正式收录比浊法，与管碟法并列成为抗生素效价测定的标准方法之一。比浊法是利用抗生素在液体培养基中对实验革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。国内已有基于比浊法的抗生素效价测定仪，但是主要用于药品、制剂的纯度检验，还没有针对废水进行应用。我国现行的药典中采用比浊法对部分药品或制剂进行效价纯度检测，但是其测定对象仍然是比较单纯的某一抗生素药品或制剂，即药典中的效价方法的对象是单一抗生素药品制剂的检验，不涉及混合抗生素。具体是针对某一种抗生素供试品与其标准品的对照来计算供试品的效价(供试品与标准品种类一致)，而混合抗生素的效价由于没有比较的标准，因此还未见采用比浊法测定废水等环境样品的效价。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有抗生素残留生物效价测定存在的技术的问题，提供一种具有普适性的废水中抗生素的生物效能的评估方法，本专利技术方法能够对含有不同种类抗生素及具有抗菌活性基团的抗生素代谢产物的废水的残留生物效能进行准确测定，操作简便，对不同类抗生素废水的残留生物效能的评价具有普适性和通用性。为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供，包括如下顺序进行的步骤:I)采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌(G+)的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线；2)富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；3)用无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混合均匀，采用比浊法测定吸光度；4)将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌-标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。其中，所述革兰氏阳性菌选择金黄色葡萄球菌。特别是，以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合溶液在波长为530nm处的吸光度值为纵坐标绘制获得所述革兰氏阳性菌-标准参照抗生素标准曲线。其中，步骤I)中所述标准参照抗生素的筛选包括如下顺序进行的步骤:1A)将革兰氏阳性菌(G+)接种于抗生素III号培养基中，摇匀，培养，制得革兰氏阳性菌标准菌液，备用；1B)精确称取抗生素标准品，溶解，配制成不同浓度的抗生素溶液，接着加入革兰氏阳性菌菌液(G+)，混合均匀后在530nm波长下进行比浊测定，测定革兰氏阳性菌与不同浓度的抗生素溶液的混合液的浊度吸光度值；1C)以抗生素浓度的对数值为横坐标，以革兰氏阳性菌与抗生素的混合液的吸光度值为纵坐标绘制所述革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线；1D)根据得到的革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线，以标准曲线的斜率以及综合因子作为筛选依据，筛选得到针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素为红霉素，其中所述综合因子为革兰氏阳性菌-抗生素的标准曲线的线性浓度范围内的高浓度与低浓度比值与标准曲线的斜率之积。其中，步骤1A)中所述培养的温度为35_37°C。特别是，所述革兰氏阳性菌标准菌液在波长5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估废水中抗生素的残留生物效能的方法，包括如下顺序进行的步骤：1）采用比浊法筛选针对革兰氏阳性菌的标准参照抗生素，并获得革兰氏阳性菌‑标准参照抗生素标准曲线；2）富集和纯化废水中的抗生素类物质，获得抗生素类富集物；3）无菌水溶解抗生素类富集物后加入革兰氏阳性菌菌液，混匀，采用比浊法测定吸光度；4）将测定得到的吸光度值代入革兰氏阳性菌‑标准参照抗生素的标准曲线中，获得废水中抗生素类物质的综合生物效能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张昱，张红，杨敏，刘苗苗，田哲，高迎新，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11