人源化的通用轻链小鼠制造技术

本申请提供了一种小鼠、组织、细胞和遗传物质，其包括人源化的重链免疫球蛋白基因座、表达通用轻链的人源化的轻链基因座和编码ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。本申请提供了一种小鼠，其表达包括人可变结构域的人源化的重链，并且其表达包括人可变结构域的人源化的轻链，其中所述轻链衍生自不超过一个，或不超过两个轻链V和J或重排的V/J序列。本申请提供了表达具有通用轻链和人源化重链的抗体的可生育的雄性小鼠。本申请提供了用于制备双特异性结合蛋白的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本申请提供了一种小鼠、组织、细胞和遗传物质，其包括人源化的重链免疫球蛋白基因座、表达通用轻链的人源化的轻链基因座和编码ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。本申请提供了一种小鼠，其表达包括人可变结构域的人源化的重链，并且其表达包括人可变结构域的人源化的轻链，其中所述轻链衍生自不超过一个，或不超过两个轻链V和J或重排的V/J序列。本申请提供了表达具有通用轻链和人源化重链的抗体的可生育的雄性小鼠。本申请提供了用于制备双特异性结合蛋白的方法和组合物。【专利说明】人源化的通用轻链小鼠
用于制备编码人免疫球蛋白重链可变结构域的序列和抗体包括双特异性抗体和包括包含通用轻链的双特异性抗体的基因修饰小鼠、细胞、胚胎、组织和分离的核酸。包括具有在内源性小鼠重链可变基因座的种系取代的基因修饰小鼠的组合物和方法，所述小鼠包括经修饰的轻链基因座，所述轻链基因座表达衍生自不超过一个或两个不同的轻链V基因片段的轻链，其中所述小鼠在其种系进一步经基因修饰以使得具有这些修饰的雄性小鼠能够繁殖。本申请提供了表达通用轻链和人源化的重链可变结构域的基因修饰小鼠，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。
技术介绍
用于人类治疗的抗体的发展具有漫长而复杂的历史。一个显著的进步已经使基本上完全人抗体序列能够用于设计有效的人用疗法，其具有降低的潜在免疫原性。现已存在的小鼠是在其种系中进行修饰以产生衍生自未经重排的基因片段(轻链和重链)的人抗体序列，所述未重排的基因片段要么作为基因修饰，要么作为在内源性小鼠的免疫球蛋白基因座的取代。在小鼠的内源性基因座中使用人的可变序列取代小鼠的可变序列，如VELOC丨MMUME?人源化的小鼠，使得小鼠免疫系统的功能基本上正常。其结果是,将这些小鼠暴露于所选择抗原会产生种类繁多、亚群丰富的克隆选择的B细胞，所述B细胞表达高亲和性体细胞突变的人可变结构域，所述结构域能够用于制备针对所选择抗原的完全人抗体。在人源化小鼠中制备的人可变结构域能够用于设计完全的人双特异性抗体，即结合蛋白，其是重链的异源二聚体，其中重链可变结构域的识别和结合特异性不同。但是选择能够有效地与重链异源二聚体结合并表达的轻链尚没有简单的解决方案。在人源化的小鼠中开发用于人类治疗的人轻链可变结构域当然是有可能的，但是选择与具有所需结合特性的重链有效地结合和表达的轻链并没有简单的解决方案，其中所述轻链不利于两条重链的表达或结合性能。因此，本领域仍需要用于开发供人类治疗使用的人免疫球蛋白可变区的组合物和方法，包括由内源性小鼠免疫球蛋白基因座的核酸序列产生的人免疫球蛋白可变区。专利技术概述本申请描述了一种小鼠，所述小鼠表达人免疫球蛋白可变结构域，所述结构域适用于双特异性结合蛋白，包括双特异性抗体，其中所述小鼠包含内源性小鼠重链可变基因座的人源化，其中包含人源化的雄性小鼠具有生育能力，并且其中所述小鼠进一步包含内源性免疫球蛋白轻链基因座的人源化，其结果为使得小鼠表达免疫球蛋白轻链库，所述库衍生自不超过一个，或者不超过两个，λ和/或K V基因片段。所提供的基因工程小鼠选择适宜的亲和成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，所述结构域衍生自未经重排的人重链V、D和J片段的库，其中所述亲和成熟的人重链可变结构域与人源化的通用轻链结合并表达。人源化的通用轻链由一个基因座表达，所述基因座包含 不超过一个或不超过两个人轻链V片段和人J片段，其可操作地与轻链恒定基因连接，或者不超过一个或不超过两个编码与轻链恒定基因可操作地连接的轻链可变结构域的重排的(νλ/JA、Vk/Jk、VA/JK或VK/JX)人核酸序列。在不同实施方式中，通用人源化的轻链结构域与多种亲和成熟的人重链可变结构域配对，其中所述的多种重链可变结构域与不同表位或抗原特异性的结合。在一个方面，提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述小鼠包括人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达不超过两个通用轻链中的一个，并且雄性的小鼠表现出野生型的生育能力。在一个方面，提供了一种经过修饰的小鼠，在其种系中在内源性的小鼠重链基因座中包含人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达通用轻链，并且其中所述小鼠包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在不同实施方式中，所述人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座在内源性的小鼠轻链基因座中。在一个实施方式中，人源化的重链免疫球蛋白可变基因座包含在内源性小鼠重链可变基因座中全部或基本上全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因片段被一个或多个人V、人D和人J基因片段所取代，其中所述的一个或多个人V、D和J片段可操作地被连接并且能够重排以形成可操作地与重链恒定序列连接的重排V/D/J基因。在一个实施方式中，所述小鼠包含设计成制备通用轻链的轻链基因座，其中所述通用轻链是衍生自包含不超过一个轻链V片段和不超过一个轻链J片段的轻链基因座或者包含单一重排的轻链V/J序列的轻链基因座的轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含包括单一人免疫球蛋白轻链V片段的免疫球蛋白轻链基因座，所述的V片段能够与人轻链J基因片段(选自一个或多个J片段)重排并且编码人轻链可变结构域。在另一个实施方式中，所述小鼠在轻链基因座包含不超过两个人轻链V片段，其中各V片段均能够与人J基因片段(选自一个或多个轻链J片段)重排并且编码重排的人轻链可变结构域。在一个实施方式中，单一的人轻链V片段可操作地与人轻链J片段连接，所述J片段选自J K 1、J K 2、J K 3、J K 4和J K 5，其中所述的单一人轻链V片段能够重排以形成编码具有任意所述一个或多个人轻链J片段的轻链可变区域基因的序列。在一个实施方式中，所述小鼠包含内源性的轻链基因座，其包含全部或基本上全部的小鼠V和J基因片段被不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列所取代。在一个实施方式中，所述的不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列选自人VK 1-39J K 5,Vk 3-20J κ I 及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性轻链基因座，所述基因座能够表达小鼠轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠在κ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在λ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与人或小鼠前导序列连接。在一个实施方式中，所述前导序列是小鼠前导序列。在一个特定实施方式中，所述小鼠前导序列是小鼠V K 3-7前导序列。在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与免疫球蛋白启动子序列连接。在一个实施方式中，所述启动子序列是人启动子序列。在一个特定实施方式中，所述人免疫球蛋白启动子是人Vk 3-15启动子。在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列可操作地与轻链免疫球蛋白恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因是小鼠Ck基因。在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列存在于κ轻链基因座，并且所述K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠，在其种系中包括：(a)人源化的免疫球蛋白重链可变基因座，包括至少一个未重排的人V、至少一个未重排的人D和至少一个未重排的人J片段，所述重链可变基因座可操作地与重链恒定区基因连接；(b)人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座，包括不超过一个，或不超过两个重排的人轻链V/J序列，所述轻链可变基因座可操作地与轻链恒定区基因连接；和(c)编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦克沃克，L·麦克唐纳德，S·史蒂文斯，S·戴维斯，D·R·巴克勒，K·A·霍西阿瓦，A·J·莫菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US