本发明专利技术提供了编码重组人IFN-β-1a的核酸序列，包含该核酸序列的表达质粒和转染有该质粒的稳定细胞系以及利用该细胞系大规模生产重组人IFN-β-1a的发酵方法。使用所述发酵方法生产重组人IFN-β-1a的产量可达60.52mg/L，比活为282,000MIU/mg。此外，本发明专利技术还提供了从稳定细胞系获得高纯度的人重组IFN-β-1a的的纯化方法，纯化后的重组人重组IFN-β-1a蛋白的纯度在98%以上，且具有同市售商品化人重组IFN-β-1a相当的体外活性。相对于以往的纯化方法，本发明专利技术的纯化方法保持了蛋白样品的活性，简化了后续的纯化步骤，并可以获得更高的产率，更适于工业的大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了编码重组人IFN-β-1a的核酸序列，包含该核酸序列的表达质粒和转染有该质粒的稳定细胞系以及利用该细胞系大规模生产重组人IFN-β-1a的发酵方法。使用所述发酵方法生产重组人IFN-β-1a的产量可达60.52mg/L，比活为282,000MIU/mg。此外，本专利技术还提供了从稳定细胞系获得高纯度的人重组IFN-β-1a的的纯化方法，纯化后的重组人重组IFN-β-1a蛋白的纯度在98%以上，且具有同市售商品化人重组IFN-β-1a相当的体外活性。相对于以往的纯化方法，本专利技术的纯化方法保持了蛋白样品的活性，简化了后续的纯化步骤，并可以获得更高的产率，更适于工业的大规模生产。【专利说明】重组人IFN-PHa及其生产和纯化方法
本专利技术属于生物制品
，涉及一种重组人IFN-β-1a稳定细胞系的构建、重组人IFN-β -1a的大规模生产及其纯化。
技术介绍
1957年,英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素(IFN)。1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，引起了人们对干扰素抗病毒作用的关注。而后，干扰素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认识(A.Yabrov.Medical Hypotheses,Vo15，Issue7:769-797，1n Bresser.Biochimie, Vo189，Issue6_7:723-728)。目前在人类身上共发现α、β、Y三种类型的干扰素:α型干扰素(IFN-α)是由白细胞产生的(Wolf Peter Hofmann et.Al, Journal of Clinical Virology,Vol32, Issue2:86-91) ；β型干扰素(IFN-β )是由成纤维细胞(纤维母细胞)产生的；Y型干扰素是(IFN-Y)由免疫系统中的T细胞和自然杀伤细胞产生的(Alfons Billiauet.al, Cytokin&Growth Factor Reviews, Vol20, Issue2, 97-113)。人干扰素 β ( β 型人干扰素)是一种天然的可溶糖蛋白。有广泛的生物学活性，如抗病毒、抗增殖及免疫调节作用(Robert J.Fox, TREND in Immunology, Vol25, N0.12:632-636)。多发性硬化症(Multiple Sclerosis)是中枢神经系统和免疫有关的发炎及去髓鞘(demyelinatin)疾病。可引起各种症状，包括感觉改变、视觉障碍、肌肉无力、忧郁、协调与讲话困难、严重的疲劳、认知障碍、平衡障碍、体热和疼痛等，严重的可以导致活动性障碍和残疾。欧美地区为该疾病的高发区，是年轻人除了外伤之外导致神经障碍最常见的疾病(G.Rosati，Neurol Sci (2001) 22:117-139)。近年来，随着诊断水平的提高以及对该病认识程度的增加，亚洲国家如日本、中国等，多发性硬化症的发病率呈现上升趋势(吉良润一，中华神经科杂志，2009年6月，第42卷，第6期，422-424)。由于我国人口基数巨大，因此国内市场对于有效药物的需求庞大。目前，多发性硬化症在临床上难以治愈，但是免疫调节疗法在缓解疾病症状以及预防疾病的反复发作方面效果显著。常用的免疫调节药物包括重组人干扰素β(IFN- β )，合成小妝 Glatiramer 乙酸盐及单抗药物 Natalizumab (Oliver Neuhauset.al, Journal of Neurological Sciences259 (2007):27-37)。根据多年的临床试验结果表明，重组人IFN-β不仅可以降低复发缓解型多发性硬化症患者的急性发作次数，而且还能有效延迟复发缓解型和继发缓解型多发性硬化症患者的病程进展(Ayman Tourbahet.al，Biochimie, Vol89:899-902)。人IFN-β用于多发性硬化症的治疗，主要是通过以下作用方式:一为抗病毒作用；二为抑制生长、诱导凋亡的作用；三为免疫调节的作用。目前，重组人IFN-β为治疗多发性硬化症的一线用药。主要的商品包括Merck Serono公司生产的Rebif ;以及Biogen Idec公司生产的Avonex ;仅此两个药品在2010年的销售额就达到47亿美元，市场前景非常巨大。IFN-β -1aIFN-β由166个氨基酸组成，相对分子质量为20Κ Da，是一种糖蛋白，由两个单海藻糖的寡糖链组成(Conradt et.al, Journal of Biological Chemistry,Vol262，14600-14605)。糖基化对其可溶性有重要作用，用糖肽酶F处理后，IFN-β发生沉淀。在大肠杆菌中表达的IFN-β也由于缺少糖基化而在折叠中产生错误。经人工改造过的可以在大肠杆菌中表达的突变型IFN-β，被称为IFN-13-lb，而天然形式的IFN-β称为IFN-β-la。IFN-β-1b的N端减少一位氨基酸，并且17位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸，这种人工改造的突变体虽然可以在大肠杆菌中表达，但是却缺乏糖基化修饰，活性仅为天然形式IFN-β-1a的十分之一(Rudick RA et.al, Experimental CellResearch, 317 (2011): 1301-1311)。天然形式IFN-β-1a通常使用真核细胞进行表达，如人胚肾细胞ΒΗΚ21，小鼠结缔组织纤维细胞LTK，中国仓鼠卵巢细胞CHO等(Reiser Wet.at, Drug Research, 37 (I):482-485 ；Chernajovsky et.al, DNA, Vol3, 297-308 ；InnisMA et.al, Methods Enzymol, 1986:397-403)。美国专利US4966843公开了一种人IFN-β -1a表达载体，以及利用这种载体在CHO细胞中表达人IFN-β -la，但该方法得到的表达量仅为2.2mg/L。另外，W02007/022799专利也公开了一种生产人IFN-P-1a的方法，该方法得到的稳定细胞系在反应器中仅能得到20mg/L的产量；其在生物反应器中采用了微载体的培养方法，该方法对微载体及血清的消耗非常巨大，增加了生产成本；同时，该方法在生产中采用了三步降温的方式，在实际生产过程中操作繁琐；另外，在生长期向生产期转换过程中需要对生长期血清进行冲洗，不可避免的造成终产物的 血清残留；再次，微载体的生产方法对于工业化生产的规模放大比较困难。IFN-β-1a 的纯化已有一些文章和专利报道了 IFN-β-1a的纯化方法，如亲和色谱(U.S.Pat.N0.4，278，661，U.S.Pat.N0.4，289，689 和 U.S.Pat.N0.4，521，952)，可控多孔玻璃色谱(U.S.Pat.N0.4，359，389，U.S.Pat.N0.5，066，786 和 U.S.Pat.N0本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸，其编码人IFN‑β‑1a且包含SEQ ID No.1所示的核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋楠萌，涂祁鹏，杜伯雨，张磊，薛剑峰，刘家望，赵娟，金孟燮，
申请(专利权)人：北京韩美药品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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