一种高通量核酸分析方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高通量基因分析方法及其应用，具体地，包括步骤：对于待分析的n种目的核酸片段，针对每个目的核酸片段，提供结合于所述目的核酸片段的不同结合区的至少2个特异探针，所述的各特异探针具有特异结合区和通用序列区，并且所述的特异结合区的序列与目的核酸片段的结合区的序列互补，而所述通用序列区的序列对应于高通量单分子或单分子扩增簇测序平台的测序引物序列，其中n为≥40的正整数；将含待分析的目的核酸片段的核酸样本与所述探针杂交，并连接所述探针，从而获得探针连接产物的混合物；用所述测序引物对探针连接产物混合物或其扩增产物进行测序，并进行分析，从而实现高通量目的基因片段的定量分析的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量核酸分析方法及其应用
本专利技术属于生物
和分子诊断领域，具体地，本专利技术涉及一种高通量核酸分析方法及其应用。
技术介绍
基因是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。除了部分病毒遗传物质是RNA外，几乎所有非病毒生物的遗传物质是DNA。不同物种都有其特异的基因序列，因此通过检测样品中的基因序列可以判断样品中存在的生物种性。生命过程中，基因通过DNA转录成mRNA,然后以mRNA为模板，翻译出有生物活性的蛋白质分子，从而将贮存在DNA序列中遗传信息表现出来。通过分析不同组织中各mRNA的量，并结合不同组织的生理功能差异，可以了解基因的功能，因此基因的表达分析是分子生物学研究基因功能最基本的研究手段之一。基因的表达受到多种调控因子的共同协调作用，其中DNA的甲基化是调控基因表达的重要方式之一。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而达到控制基因表达的目的。绝大多数情况下，甲基化主要发生在CpG序列中的胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶环的5位碳原子上。另外，基因在复制过程中也会出现差错产生“突变”，这种突变包括点突变、大片段缺失/重复(称为拷贝数多态，CNV)、基因倒位或基因易位等。有的突变会严重影响关键基因的功能从而导致疾病，由于受到选择作用，尽管这类突变在群体中的频率非常低，相当一部分突变由于并未严重影响基因功能或影响的基因并不对个体造成生存压力，它们在群体中会保留下来并由于受到随机漂变以及奠基者效应发生频率的改变，从而成为群体中的一种遗传多态，对于单碱基或寡碱基改变的多态被称之为单核苷酸多态（SNP），而对于大区段的缺失或重复多态被称之为拷贝数多态（CNP）。遗传多态以及基因突变分析是研究基因功能以及遗传性疾病的致病机理最常见的遗传分析方法。因此，基因鉴定、基因表达分析、DNA甲基化分析、突变筛查、SNP分型、CNP分型以及CNV检测是重要的分子遗传学研究手段，而且在临床分子诊断上也有着广泛的应用。正因为这些遗传分析的重要性，对于每一种分析，科学家及工程师们都开发出了多种检测方法。早期的检测方法主要针对有限的目的片段分析。采用PCR扩增对目标基因鉴定，或采用实时荧光定量PCR进行基因表达水平、病毒含量、基因拷贝数以及甲基化水平的鉴定。常见的DNA甲基化分析主要针对亚硫酸处理后的DNA进行甲基化测序或甲基化特异PCR分析。突变筛查主要是采用PCR扩增和Sanger法测序，然后通过比较测序序列与参照序列获得突变情况。用于SNP检测的方法也很多，如TaqMan探针等位基因检测技术、限制性内切酶反应（RFLP）、高分辨率融解曲线反应、单碱基延伸技术（飞行时间质谱平台、MultiplexSNaPshot）、高温连接酶检测技术（LDR,SNPscan）等。中小通量CNV的检测方法主要包括实时定量PCR、FISH、多重连接探针扩增技术（MLPA）、多重荧光竞争PCR技术（AccuCopy）等。上述方法灵活性很高，但最大的缺陷是通量太低，对于需要检测大量基因位点的研究项目或诊断需求时显得无能为力。微阵列芯片（Microarray）以高密度探针阵列为特征，这些微阵列上"印"有大量已知部分序列的DNA探针,利用分子杂交原理，将各种处理过的荧光标记样本与微阵列探针进行杂交，然后经过洗涤去除非特异杂交信号，最后用扫描仪进行荧光检测，根据荧光信号的强弱以及荧光信号所在的阵列位置确认目的基因相关的信号量。该芯片能够同时实现成千上万甚至是数百万基因片段或多态位点的分析，被广泛应用于物种鉴定、表达谱分析、高通量SNP分析、全基因组甲基化水平分析以及全基因组拷贝数分析等等。微阵列芯片最大的优势就是高通量，能够在整个基因组水平上分析基因的变化，但其缺陷是由于普遍存在非特异性杂交，定量的准确性较差，同时需要昂贵的杂交及扫描仪器，成本高而且定制芯片时间长费用高，对未知基因无法实现检测。第二代测序技术的出现给基因检测领域带来个革命性的变化。第二代测序技术的主要原理为芯片单分子PCR扩增后测序，如Illumina公司的MiSeq、GAIIx、Hiseq2000测序仪、ABI公司的IonPGM、Solid测序仪、Roche公司的454GSFLX测序仪等。第二代测序技术能够同时实现数百万个甚至是数亿个单分子扩增产物的测序，它广泛应用于基因组重测序快速鉴定致病基因、转录组分析、甲基化谱、microRNA鉴定、全基因组水平的蛋白-DNA相互作用研究以及新物种的基因组测序等等。新一代以单分子直接测序的技术也在快熟研究发展中，主要代表公司为PacificBiosciences及Helicos。这种高通量测序技术的最大的优势就是通量很大，而且能够同时实现对已知或未知基因进行鉴定并定量，应此特异性及效率都非常高。但也存在一些不足之处，主要是相对于常规测序，下一代测序的准确性稍差，单分子扩增引入的突变对最后的结果分析会造成影响，再则该技术平台适合整个基因组或转录组的检测，如果要实现对目的区域或一组基因的检测分析，需要事先对样本进行目的基因区段的富集。目前采用的富集方法有针对有限基因区域的多重PCR及微流体数字PCR等技术，而针对大量基因区域方法主要是利用覆盖目的区域的高密度探针序列与样本进行固相或液相杂交将目的区域富集。这些富集技术主要用于候选基因的突变检测，但由于这些富集过程在一定程度上消除了产物与原始模板量的正比关系，因此不能准确实现对富集的候选基因片段进行定量分析，如表达量以及拷贝数分析。因此目前本领域对于基因的检测，特别是基因鉴定、基因表达分析、DNA甲基化分析、突变筛查、SNP分型、CNP分型以及CNV检测中，尚缺乏有效的检测方法，因此迫切需要开发一种有效的高通量基因分析方法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是提供一种高通量基因分析方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种高通量核酸分析方法，包括步骤：(1)对于待分析的n种目的核酸片段，针对每个目的核酸片段，提供结合于所述目的核酸片段的不同结合区的至少2个特异探针，所述的各特异探针具有特异结合区和通用序列区，并且所述的特异结合区的序列与目的核酸片段的结合区的序列互补，而所述通用序列区的序列对应于测序引物的序列，其中n为≥40的正整数；(2)将含有待分析的目的核酸片段的核酸样本与步骤(1)所述的探针杂交，并连接所述探针，从而获得探针连接产物的混合物，其中各探针连接产物的3’和5’端都是序列对应于测序引物序列的通用序列区；(3)对步骤(2)的探针连接产物的混合物进行测序，和/或分析，从而获得目的核酸的信息。在另一优选例中，所述的测序引物为高通量单分子或单分子扩增簇测序平台的测序引物。在另一优选例中，n为≥100的正整数，较佳地为：选自1000-10000的正整数。在另一优选例中，所述通用序列区的序列对应于测序引物序列表示：通用序列区的序列与测序引物序列完全相同或至少8bp相同，或通用序列区的序列与测序引物序列完全互补或至少8bp互补。在另一优选例中，所述特异探针还具有选自下组的一个或多个特征：（1）所述特异探针的长度≤100bp，优选地为30-70bp，更优选为40-50bp。（2）所述特异探针的特异结合区的长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量核酸分析方法，其特征在于，包括步骤：(1)对于待分析的n种目的核酸片段，针对每个目的核酸片段，提供结合于所述目的核酸片段的不同结合区的至少2个特异探针，所述的各特异探针具有特异结合区和通用序列区，并且所述的特异结合区的序列与目的核酸片段的结合区的序列互补，而所述通用序列区的序列对应于测序引物的序列，其中n为≥40的正整数；(2)将含有待分析的目的核酸片段的核酸样本与步骤(1)所述的探针杂交，并连接所述探针，从而获得探针连接产物的混合物，其中各探针连接产物的3’和5’端都是序列对应于测序引物序列的通用序列区；(3)对步骤(2)的探针连接产物的混合物进行测序，和/或分析，从而获得目的核酸的信息。

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的高通量核酸分析方法，其特征在于，包括步骤：(1)对于待分析的n种目的核酸片段，针对每个目的核酸片段，提供结合于所述目的核酸片段的不同结合区的至少2个特异探针，所述的各特异探针具有特异结合区和通用序列区，并且所述的特异结合区的序列与目的核酸片段的结合区的序列互补，而所述通用序列区的序列对应于测序引物的序列，其中n为≥40的正整数；(2)将含有待分析的目的核酸片段的核酸样本与步骤(1)所述的探针杂交，并连接所述探针，从而获得探针连接产物的混合物，其中各探针连接产物的3’和5’端都是序列对应于测序引物序列的通用序列区；(3)对步骤(2)的探针连接产物的混合物进行测序，和/或分析，从而获得目的核酸的信息；其中，每个目的核酸片段对应的2个探针为：5’端探针和3’端探针，所述的5’端探针能够与位于待分析的目的核酸片段3’端的结合区互补，所述的3’端探针能够与位于待分析的目的核酸片段5’端的结合区互补，并且所述的3’端探针的3’端和5’端探针的5’端进行抗核酸外切酶的修饰保护；并且，在所述步骤(2)中，进行多次变性-复性-连接循环。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异探针还具有选自下组的一个或多个特征：(1)所述特异探针的长度≤100bp；(2)所述特异探针的特异结合区的长度为≤50bp；(3)特异探针的通用序列区长度为≥8bp；(4)所述特异探针的通用序列区的序列还对应于扩增引物序列；(5)所述特异探针包括标签序列。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异探针的长度为30-70bp。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异探针的长度为40-50bp。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异探针的特异结合区的长度为15-35bp。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异探针的特异结合区的长度为20-25bp。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，特异探针的通用序列区长度为15-35bp。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，特异探针的通用序列区长度为20-25bp。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述的3’端探针的5’端进行磷酸化修饰。10.如权利要求9所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜正文，杨锋，
申请(专利权)人：上海天昊生物科技有限公司，天昊生物医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31