定形内胚层制造技术

本发明专利技术公开了包括定形内胚层细胞的细胞培养物及其制备方法。本发明专利技术也公开了基本纯化的定形内胚层细胞的细胞群及从其它细胞类型中分离、富集及纯化定形内胚层细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
定形内胚层本申请是申请日为2004年12月23日、申请号为200480038720.1的同名申请的分案申请。相关申请本申请为非临时申请，在35U.S.C.§119(e)项的规定下享有于2003年12月23日提交的美国临时专利申请号60/532,004、名称为《定形内胚层》的优先权，在35U.S.C.§119(e)项的规定下还享有于2004年7月9日提交的美国临时专利申请号60/586,566的名称为《用于分离定形内胚层的化学因子细胞表面受体》项的优先权，以及在35U.S.C.§119(e)项的规定下享有于2004年7月14日提交的美国临时专利申请号60/587,942，名称为《用于分离定形内胚层的化学因子细胞表面受体》的优先权。本文将上面列出的各优先权申请的公开全部引入，以供参考。专利
本专利技术涉及医药和细胞生物学领域。特别是，本专利技术涉及组合物，包括哺乳动物定形内胚层细胞及制备、分离及使用这些细胞的方法。专利技术背景在1994年，首次在不具有成纤维细胞滋养物的培养物中分离了人多能干细胞,例如胚胎干(ES)细胞和胚胎生殖(EG)细胞(Bongsoetal.,1994)，然后在具有成纤维细胞滋养物的培养物中分离了这些干细胞(Hogan,1997)。后来，Thomson、Reubinoff和Shamblott使用使有丝分裂失活的小鼠滋养层建立了人ES和EG细胞的连续培养物(Reubinoffetal.,2000；Shamblottetal.,1998；Thomsonetal.,1998)。人ES和EG细胞(hESCs)为研究人的早期发育和对一些诸如糖尿病和帕金森氏病的疾病治疗干预提供了新的机会。例如，使用源于hESCs的产生胰岛素的细胞将对目前的利用供体胰腺细胞的细胞治疗方法提供巨大的改善。然而，目前还不了解怎样从hESCs产生生成胰岛素的β细胞。同样地，目前对糖尿病的利用来自供体胰腺的胰岛细胞的细胞治疗受到了移植所需的高质量胰岛细胞短缺的限制。对一个I型糖尿病患者的细胞治疗需要移植大约8x108的胰腺胰岛细胞(Shapiroetal.,2000；Shapiroetal.,2001a；Shapiroetal.,2001b)。同样地，就需要至少两个健康供体器官以获得足够的胰岛细胞进行成功的移植。HESCs提供了一种起始材料的来源，从该材料发展出基本量的高质量的分化细胞用于人细胞治疗。使hESCs非常适于细胞治疗应用的两种特性是多能性和在长期的培养中保持这些细胞的能力，不会发生遗传变化的积累。多能性是指hESCs分化为所有3种原始生殖细胞层(内胚层、中胚层、外胚层)的衍生物的能力，随后这些原始生殖细胞层形成成体的所有体细胞类型和胚外组织(如，胎盘)以及生殖细胞。虽然多能性赋予了hESCs特别的有用性，但这种特性也给研究和操作这些细胞及其衍生物带来了特殊的挑战。由于在分化的hESC培养物中可能产生大量细胞类型，因此，绝大多数细胞类型产生的效率很低。此外，成功评价任何既定细胞类型的产生关键依赖于确定合适的标志物。实现高效率的定向分化对于hESCs的治疗应用非常重要。为了将hESCs作为起始材料用来产生可用于细胞治疗应用的细胞，克服前述问题是有益的。例如，为了达到胰岛细胞移植治疗需要的细胞材料水平，在分化的最早期，将hESCs高效率地定向分化为胰岛/β细胞系是有利的。除分化过程的高效定向分化以外，沿着分化途径向胰岛/β细胞系分化的中间细胞类型的分离和定性，并且将这种细胞作为合适的谱系前体用于分化中的其它步骤，也是有益的。专利技术概述本专利技术的一些实施方案涉及包括定形内胚层细胞的细胞培养物，其中所述的定形内胚层细胞为多能细胞，能分化成肠管细胞或衍生于肠管的器官。根据一些实施方案，定形内胚层细胞为哺乳动物细胞，以及在优选实施方案中，定形内胚层细胞为人细胞。在本专利技术的一些实施方案中，定形内胚层细胞表达或不显著表达特定的标志物。在一些实施方案中，定形内胚层细胞表达一或多种标志物，所述标志物选自SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1。在其它实施方案中，定形内胚层细胞不显著表达一或多种标志物，该标志物选自OCT4、α-胎蛋白(AFP)、凝血调节蛋白(TM)、SPARC及SOX7。根据本专利技术的其它实施方案，描述了从多能细胞产生定形内胚层的方法。在本专利技术的一些实施方案中，将一种或多种生长因子用于从多能细胞至定形内胚层细胞的分化过程中。这些用于分化过程的一种或多种生长因子可包括来自TGFβ超家族的生长因子。在这些实施方案中，所述一种或多种生长因子包括Nodal/活化素和/或生长因子TGFβ超家族的BMP亚群。在一些实施方案中，所述一种或多种生长因子选自Nodal、活化素A,活化素B、BMP4、Wnt3a或任何这些生长因子的组合。本专利技术实施方案还涉及富集于定形内胚层细胞中的细胞群。在某些实施方案中，将所述定形内胚层细胞分离或基本纯化。在一些实施方案中，所述分离或基本纯化的定形内胚层细胞表达SOX17和/或CXRC4标志物，其表达程度高于OCT4、AFP、TM、SPARC和/或SOX7标志物。还提供了富集具有定形内胚层的细胞群的方法。在一些实施方案中，可将定形内胚层细胞从混合细胞群体中分离或基本纯化，通过将所述细胞与一种试剂接触，该试剂与一种分子结合，该分子位于定形内胚层细胞表面，而不是混合细胞群体中的其它细胞表面，然后分离与试剂结合的细胞。在某些实施方案中，位于所述定形内胚层细胞表面的分子为CXCR4。本专利技术的其它实施方案还涉及CXCR4抗体，SDF-1配体或CXCR4的其它配体，其用于获得富集的、分离的或基本纯化形式的定形内胚层细胞。例如，可将CXCR4抗体、SDF-1配体或CXCR4的另一种配体用作诸如亲和分离或磁分离的方法中的试剂，以富集、分离或基本纯化与所述试剂结合的定形内胚层细胞。本文所述的本专利技术的其它实施方案涉及诸如细胞培养物的组合物，其包括多能细胞和定形内胚层细胞。在某些实施方案中，细胞培养物同时包括干细胞和定形内胚层细胞。这些培养物中的干细胞数目可大于、等于或小于该培养物中的定形内胚层细胞数目。在一些实施方案中，干细胞为人胚胎干细胞。在某些实施方案中，将hESCs保持在滋养层上。在这些实施方案中，所述滋养层细胞可为从人、小鼠或其它合适生物获得的诸如成纤维细胞的细胞。在本专利技术的一些实施方案中，包括定形内胚层细胞和hESCs的所述组合物还包括一种或多种生长因子。这些生长因子可包括来自TGFβ超家族的生长因子。在这些实施方案中，所述一种或多种生长因子包括Nodal/活化素和/或生长因子TGFβ超家族的BMP亚群。在一些实施方案中，所述一种或多种生长因子选自Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、Wnt3a或任何这些生长因子的组合。本专利技术的其它实施方案参考下述编号段落进行描述：1.包括人细胞的细胞培养物，其中至少约10％的所述人细胞为定本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括人细胞的细胞培养物，其中至少约10%的所述人细胞为定形内胚层细胞，所述的定形内胚层细胞为能分化成肠管细胞或衍生于肠管的器官的多能细胞。

【技术特征摘要】
2003.12.23 US 60/532,004;2004.07.09 US 60/586,566;1.产生能支持多能细胞分化成定形内胚层细胞的培养基的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含10％或少于10％(v/v)血清的所述培养基；以及
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A；
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A和Wnt家族成员；
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A和活化素B；或者
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A、活化素B和Wnt家族成员，
其中所述活化素A的量为至少30ng/ml。


2.权利要求1的方法，其中所述Wnt家族成员是Wnt3a。


3.权利要求1的方法，其中所述培养基包含少于5％血清。


4.权利要求1的方法，其中所述培养基包含少于2％血清。


5.产生能培养人定形内胚层细胞的培养基的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含10％或少于10％(v/v)血清的所述培养基；以及
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A；
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形内胚层细胞的量的活化素A和Wnt家族成员；
给所述培养基提供足以促进多能细胞分化成定形...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·艾伦·德阿姆尔，艾兰·D·奥戈尔尼克，埃马纽埃尔·E·拜特格，
申请(专利权)人：维亚希特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US