用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，包括如下步骤：麻醉并固定小鼠；在第0天，用抗原对小鼠的接近淋巴结的10个位点进行皮下注射，分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2μg；在第3天用抗原对小鼠的上述10个位点的相近位点进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2μg；在第7天用抗原对小鼠的后脚的两个足垫进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21μg；在第12~14天，取小鼠的淋巴结制成单细胞悬液，得到用于细胞融合的淋巴细胞。这种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，免疫时间较短且较节省抗原。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，包括如下步骤：麻醉并固定小鼠；在第0天，用抗原对小鼠的接近淋巴结的10个位点进行皮下注射，分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2μg；在第3天用抗原对小鼠的上述10个位点的相近位点进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2μg；在第7天用抗原对小鼠的后脚的两个足垫进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21μg；在第12~14天，取小鼠的淋巴结制成单细胞悬液，得到用于细胞融合的淋巴细胞。这种，与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，免疫时间较短且较节省抗原。【专利说明】
本专利技术涉及免疫学领域，特别是涉及一种。
技术介绍
单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合的B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏或淋巴结中分离出来的，免疫后的脾脏和淋巴结中含有大量分泌高亲和力和高特异性抗体的B细胞。选择合适的动物免疫方案是获得高质量的McAb的首要前提。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。传统的用于细胞融合的淋巴细胞的多采用腹腔及皮下注射免疫的方法制备，制备时采用的抗原包括颗粒性抗原和可溶性抗原。颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。以细胞性抗原为例，第一次腹腔或尾静脉注射I X 1(TI X IO7细胞/鼠，间隔2~3周重复注射f 2次，融合前3d用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原,应先制备成人工免疫原，再加佐剂。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。一般取5(T100yg抗原与等量完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后腹腔或背部皮下多点注射，以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂腹腔或皮下注射，共3飞次，一般在融合前3d腹腔或静脉注射无佐剂抗原50-100 μ g加强免疫。这是目前最常用的免疫方式。然而，腹腔及皮下注射免疫的方法制备用于细胞融合的淋巴细胞，免疫周期较长，至少需要4次以上的免疫后才能进行细胞融合，免疫时间至少需2个月以上；同时对抗原的需求量大，一般需100-200μ g/次/鼠，这大大地增加了单克隆抗体制备的成本，特别是对价格昂贵的抗原。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种免疫时间较短且较节省抗原的。一种，用于单克隆抗体制备，包括如下步骤:步骤一、麻醉并固定小鼠；步骤 二、在第O天，用抗原对步骤一得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，所述10个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8^2.2 μ g ;步骤三、在第3天用所述抗原对步骤二得到的小鼠的所述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原 量为0.8^1.2 μ g ;步骤四、在第7天用所述抗原对步骤三得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为1扩21 μ g ；步骤五、在第12~14天，取步骤四得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到所述用于细胞融合的淋巴细胞。在一个实施例中，所述抗原为颗粒性抗原。在一个实施例中，所述抗原为用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原。在一个实施例中，步骤一中，所述小鼠为6~8周龄的雌性BALB/C小鼠。在一个实施例中，步骤一中，所述麻醉小鼠的操作具体为用苯巴比妥钠对所述小鼠进行腹腔注射，剂量为100mg/kg。在一个实施例中，步骤五中，所述淋巴结为两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结中的至少一个。在一个实施例中，步骤五中，还包括检测小鼠血清效价在1:3200以上的操作。这种，具有免疫速度快的优点，12~14天即可完成免疫；同时需要的抗原量少，总共仅需70μ g/鼠。与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，这种免疫时间较短且较节省抗原，从而有效地降低单克隆抗体制备的时间和成本。【专利附图】【附图说明】图1为一实施方式的；图2为小鼠的接近淋巴结的10个位点的示意图；图3为用于研磨制成单细胞悬液并用于细胞融合的小鼠的淋巴结的示意图。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。一实施方式的，如图1所示，步骤如下。一种，用于单克隆抗体制备，包括如下步骤:S10、麻醉并固定小鼠。小鼠可以为6~8周龄的雌性BALB/C小鼠。麻醉剂可以为苯巴比妥钠，腹腔注射的剂量为100mg/kg。S20、在第O天，用抗原对SlO得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，10个位点具体为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8^2.2 μ g。抗原可以为颗粒性抗原，也可以可溶性抗原。颗粒性抗原可以直接使用，可溶性抗原需要用弗氏完全佐剂乳化。用弗氏完全佐剂乳化的可溶性抗原中。弗氏完全佐剂与可溶性抗原的比例范围可以较宽，只要能够将可溶性抗原完全乳化即可。可以使得弗氏完全佐剂与可溶性抗原的体积比为1:1。如图2所示，S20中用抗原对小鼠进行注射的10个接近淋巴结的位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点。在优选的实施方式中，每个位点注射的抗原量为2 μ g。S30、在第3天用抗原对S20得到的小鼠的上述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8^1.2 μ g。抗原为步骤SlO采用的抗原。在优选的实施方式中，每个位点注射的抗原量为I μ goS40、在第7天用抗原对S30得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为1^21 μ g。在优选的实施方式中，每个足垫注射的抗原量为20 μ g。抗原为步骤S 10采用的抗原。S50、在第12~14天，取S40得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到用于细胞融合的淋巴细胞。如图3所示，所述小鼠的淋巴结，具体为小鼠的两侧腋窝淋巴结、前腿淋巴结、腹股沟淋巴结和后腿胭淋巴结中的至少一个。S50中还包括在取小鼠淋巴结进行研磨之前，检测小鼠血清效价在1:3200以上的操作。这种，具有免疫速度快的优点，12~14天即可完成免疫；同时需要的抗原量少，总共仅需70μ g/鼠。与传统的腹腔及皮下注射免疫的方法相比，这种免疫时间较短且较节省抗原，从而有效地降低单克隆抗体制备的时间和成本。具体实施例。实施例1用于细胞融合的淋巴细胞的制备。本实施例中采用牛血清白蛋白BSA作为抗原，弗氏完全佐剂购自sigma公司，货号为F5881，规格为10ml，雌性BALB/C小鼠购自广东省本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞融合的淋巴细胞的制备方法，用于单克隆抗体制备，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、麻醉并固定小鼠；步骤二、在第0天，用抗原对步骤一得到的小鼠的接近淋巴结的10个位点分别进行皮下注射，所述10个位点分别为颈背部的两个位点，腋窝、腹股沟、大腿和小腿的两侧并列位点，每个位点注射的抗原量为1.8~2.2μg；步骤三、在第3天用所述抗原对步骤二得到的小鼠的所述10个位点的相近位点分别进行皮下注射，每个位点注射的抗原量为0.8~1.2μg；步骤四、在第7天用所述抗原对步骤三得到的小鼠的后脚的两个足垫分别进行皮下注射，每个足垫注射的抗原量为19~21μg；步骤五、在第12~14天，取步骤四得到的小鼠的淋巴结进行研磨，制成单细胞悬液，得到所述用于细胞融合的淋巴细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，王彩霞，王宏，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44