结合磷酰胆碱（PC）和/或PC结合物的抗体制造技术

本发明专利技术涉及能够结合磷酰胆碱和/或磷酰胆碱结合物的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段包括重链可变（VH）区域和/或轻链可变（VL）区域，并且其中（a）VH区域包括选自下列的互补决定区（CDR）：CDR1序列，其与SEQ ID NO：7的序列具有序列同一性；CDR2序列，其与SEQ ID NO：8的序列具有序列同一性；和CDR3序列，其与SEQ ID NO：9或10的序列具有序列同一性；和/或（b）VL区域包括选自下列的（CDR）：CDR4序列，其与SEQ ID NO：11的序列具有序列同一性；CDR5序列，其与SEQ ID NO：12的序列具有序列同一性；CDR6序列，其与SEQ ID NO：13的序列具有序列同一性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合磷酰胆碱（PC）和/或PC结合物的抗体本申请要求2011年8月9日提交的美国临时专利申请第61/521607号的优先权，其整体通过引用并入本文。
本专利技术涉及结合磷酰胆碱（PC）和/或PC结合物且具有惊人体内有效性质的新抗体。
技术介绍
本说明书中所列或讨论的明显先前公开的文件并不必然被承认是本领域现有技术的一部分或常见的一般知识。尽管存在治疗心血管疾病的选择，急性冠状动脉综合征（ACS）仍为工业化世界死亡的头号原因。ACS的发生是冠状动脉管腔内血栓形成的结果，其与动脉壁内的慢性炎症相关。动脉炎症经由脂质核心的形成以及由导致斑块形成的炎症性细胞的浸润而起始。不稳定的斑块（plaque）含有实质性的坏死核心和凋亡细胞，其破坏内皮且可导致斑块破裂而暴露出底层胶原蛋白、冯威里氏因子（vonWillebrandfactor，vWF）、组织因子、脂质及平滑肌，而引发血小板黏附、活化和聚集（Libby等人1996）。用抗血小板疗法、降胆固醇药物治疗（如，他汀（statin）类）、抗凝血剂，以及通过经皮冠状动脉介入治疗（percutaneouscoronaryintervention，PCI）以及支架（stents）植入的外科再通术（recanalization）的组合可治疗ACS。已显示抗血小板疗法例如COX-1抑制剂（如，阿斯匹林）、ADP受体拮抗剂（如，抵克立得（Ticlopedine）及氯吡格雷（clopidogrel））及糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂在许多不同的临床试验中降低主要不良冠状动脉事件（majoradversecaronaryevents，MACE）的发生率（Dupont等人2009）。然而，一部分接受长期抗血小板疗法的患者持续具有心血管事件。另外，慢性预防疗法可能需要多达两年才显示最大有益效果，而且许多患者接下来仍具有疾病复发的高风险。心肌梗塞后有长达6-12个月的期间，在该期间患者易发生进一步的MACE，这经常归因于由于再狭窄而导致的再闭塞（Tabas.2010）。因此，明显需要特异地针对防止进一步斑块进展并促进斑块消退的治疗，从而能够实质性降低在此期间的事件。磷酰胆碱（在某些磷脂上的极性头基团）与心血管疾病有广泛关联。冠状动脉炎症期间产生的活性氧种类造成低密度脂蛋白（LDL）氧化而产生氧化的LDL（oxLDL）。事实上，心血管疾病（CVD），例如动脉粥样硬化、不稳定型心绞痛或急性冠状动脉综合征已显示与血浆的oxLDL水平上升有关联（Itabe和Ueda.2007）。LDL为循环脂蛋白颗粒，其包含带有PC极性头基团的脂类和apoB100蛋白。在LDL氧化期间，产生了含有不存在于未经修饰的LDL上的新抗原表位的PC。巨噬细胞上的清道夫受体（例如CD36）识别oxLDL上新暴露的PC，并且所产生的巨噬细胞吞噬的oxLDL开始进行血管壁中促炎性泡沫细胞（proinflammatoryfoamcells）的形成。内皮细胞表面的受体也识别氧化的LDL，且已报道会刺激一系列的反应，包含内皮细胞功能失调、细胞凋亡及未折叠蛋白反应（Gora等人2010）。经磷脂酶A2或胺反应性疾病代谢物（例如由糖化蛋白氧化而产生的醛类）修饰后，PC新抗原表位也暴露于LDL上。这些另外修饰的LDL颗粒也是CVD中的促炎性因子。已显示抗磷酰胆碱（PC）的抗体结合氧化的LDL或经其他修饰的LDL，并在体内模型中或体外研究中阻止oxLDL的促炎性活性（Shaw等人2000；Shaw等人2001）。而且，临床数据的检查证实了低水平的天然IgM抗-PC抗体与ACS患者中MACE增高的风险有关（Frostegard,J.2010）。因此，需要能有效用于治疗的抗-PC抗体分子，特别是适合人类治疗的全人抗-PC抗体。就申请人所知，至今本领域仍未提供治疗上有效的人类抗-PC抗体。鉴定此类抗体受阻于下列事实：用于具有抗-PC结合活性的人类抗体的体外筛选方法对预估体内治疗活性的效果欠佳。鉴于此，本领域需要用于体内系统时提供有效且有利性质的人类抗-PC抗体分子，特别是用于人类治疗时。附图说明图1为经由Biacore的平衡结合分析评估结合亲合力。（●）X9-C01（批号：W21574）（Kd=352±59nM），（○）X9-C01（批号：W22596）（Kd=295±46nM）。图比较抗体的两种不同制剂。图2为由ELISA测量的结合PC-BSA的纯化的IgG。（●）M4-G02（EC50=0.14nM），（○）M73-G03（EC50=0.91nM），（▼）X9-C01（EC50=0.18nM）。数据以整体Bmax拟合至4个参数逻辑方程式而得到EC50估值。图3为CD45阳性白细胞流入股动脉套管小鼠中层（medial）的抑制。以含有1%胆固醇及0.05%胆酸盐的高胆固醇及高脂质饮食喂食转基因的雄性ApoE*3Leiden小鼠，以引发高胆固醇血症。经3星期高脂质饮食后，麻醉小鼠并自股动脉周围解剖股动脉且松松地套上非缩窄性聚乙烯套管（Portex，内径0.40mm，外径0.80mm及长度2.0mm）。于第0天时，经IP注射来用溶于PBS的10mg/kg重组抗-PCIgG抗体、溶于PBS的10mg/kg抗链霉亲和素A2IgG抗体或只有PBS来处理小鼠。手术后3天处死小鼠且取下套管的股动脉并以石蜡包埋。自套管的股动脉片段的全长获得连续横断面（5μm），用于组织化学法分析。*p<0.01，n=15。图4A-B为股动脉套管小鼠的内膜增厚的抑制。以含有1%胆固醇及0.05%胆酸盐的高胆固醇及高脂质饮食喂食转基因的雄性ApoE*3Leiden小鼠，以引发高胆固醇血症。经3星期高脂质饮食后，麻醉小鼠并自股动脉周围解剖股动脉且松松地套上非缩窄性聚乙烯套管（Portex，内径0.40mm、外径0.80mm及长度2.0mm）。于手术后第0、3、7及10天时，经IP注射来用溶于PBS的10mg/kg重组抗-PCIgG抗体、溶于PBS的10mg/kg抗链霉亲和素A2IgG抗体或只有PBS的任一种来处理小鼠。手术后14天处死小鼠且取下套管的股动脉并以石蜡包埋。自套管的股动脉片段的全长获得连续横断面（5μm），用于组织化学法分析。图4A.4个图中内膜面积（箭头指示处）的比较显示，抗体X9-C01降低套管引发的血管损伤14天后观察到的内膜增厚。图4B.内膜增厚（μm）2，n=10，*p<0.05图5为使用ELISA测量的X9-C01突变体的PC结合活性。（●）X9-C01（EC50=0.35nM），（○）X19-E01（EC50=0.38nM），（▼）X19-E03（EC50=0.79nM）。
技术实现思路
本申请公开了包括能够结合磷酰胆碱和/或磷酰胆碱结合物的新抗原结合区的新抗体及抗体片段的制备与测试。在第一方面中，本专利技术提供了能够结合磷酰胆碱和/或磷酰胆碱结合物的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段包括重链可变（VH）区域和/或轻链可变（VL）区域，并且其中：（a）VH区域包括包含1、2或3个选自下列的互补决定区（CDR）的氨基酸序列：CDR1序列，其包括与SEQIDNO：7的序列具有至少20%、40%、60%、80%或100%序列同一性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够结合磷酰胆碱和/或磷酰胆碱结合物的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段包括重链可变（VH）区域和/或轻链可变（VL）区域，且其中：（a）VH区域包括氨基酸序列，该氨基酸序列包含1、2或3个选自下列的互补决定区（CDR）：CDR1序列，其包括与SEQ ID NO：7的序列具有至少20%、40%、60%、80%或100%序列同一性的氨基酸序列；CDR2序列，其包括与SEQ ID NO：8的序列具有至少5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%或100%序列同一性的氨基酸序列；和CDR3序列，其包括与SEQ ID NO：9或10的序列具有至少11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%或100%序列同一性的氨基酸序列；和/或（b）VL区域包括氨基酸序列，该氨基酸序列包含1、2或3个选自下列的互补决定区（CDR）：CDR4序列，其包括与SEQ ID NO：11的序列具有至少7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%或100%序列同一性的氨基酸序列；CDR5序列，其包括与SEQ ID NO：12的序列具有至少14%、28%、42%、57%、71%、85%或100%序列同一性的氨基酸序列；CDR6序列，其包括与SEQ ID NO：13的序列具有至少9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%或100%序列同一性的氨基酸序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.09 US 61/521,6071.一种能够结合磷酰胆碱和/或磷酰胆碱结合物的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段包括重链可变(VH)区域和轻链可变(VL)区域，且其中：(a)VH区域由氨基酸序列组成，该氨基酸序列包含3个选自下列的互补决定区(CDR)：CDR1序列，其由SEQIDNO：7所示的氨基酸序列组成；CDR2序列，其由SEQIDNO：8所示的氨基酸序列组成；和CDR3序列，其由与SEQIDNO：9或10的序列具有至少88％序列同一性的氨基酸序列组成；和(b)VL区域由氨基酸序列组成，该氨基酸序列包含3个选自下列的CDR：CDR4序列，其由SEQIDNO：11所示的氨基酸序列组成；CDR5序列，其由SEQIDNO：12所示的氨基酸序列组成；CDR6序列，其由SEQIDNO：13所示的氨基酸序列组成。2.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中VH区域和VL区域以线性多肽序列存在。3.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中VH区域和VL区域每一个均以独立的多肽序列存在。4.如权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中独立的多肽序列直接或间接结合在一起。5.如权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中独立的多肽序列通过介于独立的多肽序列间的一个或多个二硫键直接或间接结合在一起。6.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中抗体为单克隆抗体。7.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中抗体片段为Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fd、dAb或scFv-Fc片段、纳米抗体及双特异抗体，或任何稳定的此类片段。8.如权利要求7所述的抗体或抗体片段，其中稳定的此类片段为利用聚乙二醇化稳定的此类片段。9.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其为人类单克隆抗体或抗体片段，或人源化单克隆抗体或抗体片段。10.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其能够结合磷酰胆碱结合物。11.如权利要求10所述的抗体或抗体片段，其中磷酰胆碱结合物为任选地经由间隔子连接至载体的磷酰胆碱部分。12.如权利要求11所述的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段特异性地结合磷酰胆碱结合物中的磷酰胆碱部分。13.一种药物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·彼得松，O·坎贝尔，丹·塞克斯顿，安德鲁·E·尼克松，
申请(专利权)人：阿瑟拉生物技术公司，戴埃克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE