本发明专利技术涉及一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用。具体地，根据生物信息学数据库预测has-mir-619-5p与MALAT1基因3’UTR区结合的位点，将其中包含该结合位点的序列扩增出来，插入双荧光素酶报告基因质粒pmirGLOvector，成功构建了MALAT1基因3’UTR区双荧光素酶报告基因质粒。该质粒可作为简单易行的工具，用于检测调控MALAT1表达的microRNA的表达量、筛选调控MALAT1表达的microRNA，以及评估microRNA对MALAT1表达的调控作用，为通过检测microRNA表达情况了解肿瘤的发生发展提供了重要手段。
【技术实现步骤摘要】
一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体地说，是一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用。
技术介绍
长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达水平。lncRNA-MALAT1（MetastasisAssociatedinLungAdenocarcinomaTranscript1）于2003年被首次发现，其在非小细胞癌患者组织中显著高表达，随后在其他很多肿瘤如肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肠癌、乳癌等癌组织中也发现MALAT1过表达。许多研究都提示MALAT1基因跟多种肿瘤的侵袭转移密切相关，而目前针对该基因进行的表达调控研究还比较少。微小RNA（microRNA，miRNA）作为一类内源性的长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，能够在转录后水平调节mRNA表达。相当一部分microRNA在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，或是癌基因，又或是抑癌基因。绝大多数microRNA是通过与靶基因的3’UTR区发生作用，或抑制靶基因的翻译，也或是降解靶基因，最终降低靶基因的表达水平，影响基因发挥应有的功能。因此microRNA对靶基因的调控研究是非常值得关注的领域。目前对于长链非编码RNA调控的研究报道并不多，既然microRNA能够对有翻译能力的靶基因发挥调控作用，其对长链非编码RNA的转录后水平也应该存在一定的调节作用。为了研究microRNA对MALAT1基因的调控作用，针对MALAT1基因的3’UTR设计相应的筛选和检测方法是非常值得研究的，这将对进一步研究MALAT1基因调控肿瘤的侵袭转移能力有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒。本专利技术的再一的目的是，提供上述质粒的制备方法。本专利技术的另一的目的是，提供上述质粒的用途。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒，所述的质粒是在pmirGLOvector的多克隆位点内插入SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选地，所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列插入在pmirGLOvector的PmeI和XbaI酶切位点之间。所述的质粒是通过以下方法构建的：a）获取序列如SEQIDNO.2所示的has-mir-619-5p与MALAT1基因结合的靶点；b）设计序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物，以人基因组为模板克隆获得NO.1所示的核苷酸序列并测序验证；c）将步骤b）得到的NO.1所示的核苷酸序列连接到pmirGLOvector的PmeI和XbaI酶切位点之间。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒的制备方法，包括以下步骤：a）获取序列如SEQIDNO.2所示的has-mir-619-5p与MALAT1基因结合的靶点，确定所要克隆的目的片段；b）设计序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物，以人基因组为模板克隆获得NO.1所示的核苷酸序列并测序验证；c）将步骤b）得到的NO.1所示的核苷酸序列连接到pmirGLOvector的PmeI和XbaI酶切位点之间。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒的用途，用于检测调控MALAT1表达的microRNA的表达量，或筛选调控MALAT1表达的microRNA，或评估microRNA对MALAT1表达的调控作用。所述的调控MALAT1表达的microRNA是has-mir-619-5p。本专利技术优点在于：本专利技术根据生物信息学数据库成功预测了has-mir-619-5p与MALAT1基因3’UTR区结合的位点，将其中包含该结合位点的序列扩增出来并适当的尽可能延长靶点两侧的序列（片段短了就可能会失去很多microRNA的结合位点(包括has-mir-619-5p)，从而不能对MALAT1起调控作用；太长的片段则不太容易PCR扩增，且可能会影响载体中荧光素酶的活性），插入双荧光素酶报告基因质粒pmirGLOvector，成功构建了MALAT1基因3’UTR区双荧光素酶报告基因质粒。该质粒可作为检测调控MALAT1表达的microRNA的表达量、筛选调控MALAT1表达的microRNA，以及评估microRNA对MALAT1表达的调控作用的简单易行的工具，为通过检测microRNA表达情况了解肿瘤的发生发展提供了很重要的手段。【附图说明】图1是has-mir-619-5p与MALAT1-3-UTR结合靶点的序列。图2是PCR扩增获得的含has-mir-619-5p结合靶点的MALAT1-3-UTR基因片段。其中，1为Marker，2和3为400bp大小的扩增片段。图3是PCR扩增MALAT1-3-UTR片段基因测序后与NCBI数据库比对的结果。图4是MALAT1-3-UTR基因片段克隆进pmirGLOvector载体后PCR鉴定重组克隆的电泳图。其中1为Marker，2和4是经PCR鉴定正确重组的克隆。图5是pmirGLO-MALAT1-3-UTR双荧光素酶报告质粒的构建流程图。图6是pmirGLO-MALAT1-3-UTR双荧光素酶报告质粒用于检测has-mir-619-5p对MALAT1调控作用的活性检测结果。其中，Noinsert是空载体pmirGLO-vector组，MALAT1-3-UTR是pmirGLO-MALAT1-3-UTR组，MALAT1-3-UTR-mut是has-mir-619-5p结合位点进行碱基突变的报告质粒组，MALAT1-3-UTR+has-mir-619-5p是pmirGLO-MALAT1-3-UTR+has-mir-619-5p模拟物组，MALAT1-3-UTR-mut+has-mir-619-5p是pmirGLO-MALAT1-3-UTR-mut+has-mir-619-5p模拟物组。图7是has-mir-619-5p模拟物作用于pmirGLO-MALAT1-3-UTR双荧光素酶报告质粒的工作原理图。图8是pmirGLO-MALAT1-3-UTR双荧光素酶报告质粒用于进一步鉴定前期基因芯片或软件预测获得的对MALAT1-3-UTR有调控作用的microRNA。其中，Control组即为pmirGLO-MALAT1-3-UTR双荧光素酶报告质粒组，未添加模拟物，1为has-mir-619-5p模拟物，2为hsa-miR-5585-3p模拟物，3为hsa-miR-5096模拟物，4为hsa-miR-574-5p模拟物，5为hsa-miR-1273g-3p模拟物，6为hsa-miR-1972模拟物。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1pmirGLO-MALAT1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒，其特征在于，所述的质粒是在pmirGLO vector的多克隆位点内插入SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)获取序列如SEQIDNO.2所示的has-mir-619-5p与MALAT1基因结合的靶点，确定所要克隆的目的片段；b)设计序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物，以人基因组为模板克隆获得SEQIDNO.1所示的核苷酸序列并测序验证；c)将步骤b)得到的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列连接到pmirGLOvector的PmeI和XbaI酶切位点之间。2.一种含有MALAT1基因3’UTR序列和双荧光素酶报告基因的质粒的用途，其特征在于，用于检测调控MALAT1表达的microRNA的表达量，或筛选调控MALAT1表达的microRNA；所述质粒是在pmirGLOvector的多克隆...
【专利技术属性】
技术研发人员：任建琳，季青，李琦，侯风刚，隋华，刘宣，周利红，陈文婷，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属市中医医院，上海中医药大学附属曙光医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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