本发明专利技术公开了一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用，该表面展示体系构建方法为：利用来源丁香假单胞菌的人工合成截短冰核蛋白的NC端为锚定蛋白与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了原核表达载体pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。在T7强启动子作用下，经IPTG诱导表达，成功实现了羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面活性的展示，并使用超低温冷冻干燥法制备全细胞催化剂D-1CarE3。全细胞催化剂D-1CarE3可应用于环境农残污染的处理。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用，该表面展示体系构建方法为：利用来源丁香假单胞菌的人工合成截短冰核蛋白的NC端为锚定蛋白与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了原核表达载体pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。在T7强启动子作用下，经IPTG诱导表达，成功实现了羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面活性的展示，并使用超低温冷冻干燥法制备全细胞催化剂D-1CarE3。全细胞催化剂D-1CarE3可应用于环境农残污染的处理。【专利说明】一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用
本专利技术属于生物工程技术和分析
，涉及一种羧酸酯酶D-lCarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。
技术介绍
羧酸酯酶(Carboxylesterases, EC3.1.1.1)是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，广泛存在于动物、植物、微生物体参与生命代谢活动，其与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，具有Ser-Asp-His三联体结构催化活性中心。微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换上等具有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景。当今农药在控制农作物病虫害促进农作物增产的同时也带来了严重的环境污染问题。羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，对含有羧酸酯键的农药有水解作用，可以用于部分有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药以及拟除虫菊酯类农药的降解。微生物降解农药残留多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、生长周期长、收集复杂、产量小，生产成本高，限制了其推广应用。利用细胞表面展示技术可以将靶蛋白羧酸酯酶转运和定位到细胞表面，无需分离纯化，是一种开发高效、可再生全细胞催化剂的新思路，适合工业大规模生产应用。冰核蛋白的N端具有表面定位功能，而C端具有细胞表面引导和定位功能,利用NC端则有利于提高其对外源蛋白的高效展示作用。本文利用来源丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的人工合成截短的冰核蛋白(Genbank登录号AF013159)的NC端为锚定蛋白与来源脂环酸芽抱杆菌 D_1 (Alicyclobacillus tengchongensis strainCGMCC1504)祀蛋白羧酸酯酶D-lCarE3 (Genbank登录号JQ034612)融合构建了原核表达质粒pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了羧酸酯酶D-lCarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21 (DE3)/pET28NCD3。利用低温冷冻干燥法制备了全细胞催化剂D_lCarE3，并将其应用于氟氯氰菊酯的降解实验中，结果表明该全细胞催化剂对拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯有降解作用，此外专利技术专利“一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因的降解中的应用”(申请号:201210401222.4)还公开了该羧酸酯酶D-lCarE3具有降解有机磷类农药中的马拉硫磷和氨基甲酸酯类农药中的西维因，这些表明细胞表面展示羧酸酯酶D-lCarE3的全细胞催化剂可应用于环境多种农残污染的处理。
技术实现思路
为了克服现有 技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种环境友好、操作方便的羧酸酯酶D-lCarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。其技术方案如下:—种羧酸酯酶D_lCarE3细胞表面展不系统,该细胞表面展不系统中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作为锚定蛋白并与革巴蛋白羧酸酯酶D-lCarE3融合构建了重组质粒PET28NCD3。一种羧酸酯酶D_lCarE3细胞表面展示工程菌，利用本专利技术所述中的重组质粒PET28NCD3转化到表达宿主BL21 (DE3)构建了细胞表面展示工程菌BL21 (DE3)/pET28NCD3。一种包含本专利技术所述工程菌BL21 (DE3) /pET28NCD3全细胞催化剂D_lCarE3的制备方法，其特征在于，取本专利技术所述工程菌株以0.1%的体积比接种量接种于含50μ g/mL卡那抗性的LB培养液中，37°C快速振荡12h，然后将此活化的菌液再以1%体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37°C振荡培养4h，待菌体密度0D600=0.5左右，加入终浓度0.05mMIPTG20°C诱导培养20h，12000rpm离心5min，收集菌体，置于超低温冷冻真空干燥机上冻成细胞干粉即为全细胞催化剂D-lCarE3。全细胞催化剂D_lCarE3在环境农残污染处理中的应用。称取Img权利要求3所述全细胞催化剂D-lCarE3加入100 μ 1100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室温震荡反应60min,加入等体积的正己烷抽提，离心取上层液适量于硅胶G板上进行簿层层析分析催化产物，结果显示全细胞催化剂D-lCarE3能够降解拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯，可应用于环境农残污染的处理。本专利技术的有益效果:本专利技术利用inaK-NC锚定蛋白成功将具有几种农药降解功能的羧酸酯酶D-lCarE3定位到细胞表面并具有生物催化活性，解决了细胞内提取其羧酸酯酶D-lCarE3难的问题，其全细胞催化剂D_lCarE3催化活性达到540U/g细胞干重，是张红星等人只利用inaK-N端锚定有机磷水解酶所获得的活性表达870倍以上。本专利技术所制备的全细胞催化剂D-lCarE3具有活细胞固定化酶的作用，将全细胞催化剂D_lCarE3放入甲醇溶液中耐受Ih回收细胞测定其催化活性无损失，将全细胞催化剂D-lCarE3常温放置42d，全细胞催化剂D-lCarE3催化活性损失不到3%，全细胞催化剂D_lCarE3克服了原始酶的不稳定性，不易回收利用的问题。本专利技术所制备的全细胞催化剂D-lCarE3可以直接喷洒到农残污染区，其制备方法和使用都很简单，具有广泛的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1是PET28NCD3质粒构建图谱；图2是BL21(DE3)/pET28NCD3细胞组分的Western blot分析图:1，为细胞质成分；2，为细胞内膜；3，为细胞外膜；4，为空质粒对照；5，为蛋白质Marker ；图3是全细胞催化剂D_lCarE3催化氟氯氰菊酯降解产物的簿层层析图，I, 2，3，为实验组；CK为对照组；产物I和产物2为氟氯氰菊酯水解的两种产物；图4是全细胞催化剂D_lCarE3稳定性。【具体实施方式】下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。实验材料和试剂1、菌株、载体或基因:脂环酸芽抱杆菌 D_1 (Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)为实验室保藏菌株。大肠杆菌Escherichia coliBL21 (DE3)和表达载体pET_28a (+)购于Novagen公司，大肠杆菌Escherichia coli TransTl购自全式金公司，ianK-NC为来源丁香假单胞菌Pseudo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羧酸酯酶D‑1CarE3细胞表面展示系统，其特征在于，该细胞表面展示系统中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作为锚定蛋白并与靶蛋白羧酸酯酶D‑1CarE3融合构建了重组质粒pET28NCD3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，谢振荣，丁俊美，唐湘华，李俊俊，许波，杨云娟，周峻沛，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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