一种重组制癌肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组制癌肽的制备方法，根据肿瘤抑素的N-端74～98氨基酸功能肽(25个氨基酸)和185-191氨基酸功能肽(7个氨基酸)两个功能区与人IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；根据所设计的序列，设计并合成引物F1、F2、R1，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；以延伸反应产物为模板，F1、R1为引物进行PCR反应，得到大小为129bp的制癌肽基因OP。构建制癌肽重组表达质粒pET-SUMO-OP，将重组质粒pET-SUMO-OP进行原核表达，并进行SDS-PAGE鉴定；纯化重组融合蛋白，得到重组制癌肽，该肽具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，根据肿瘤抑素的N-端74～98氨基酸功能肽(25个氨基酸)和185-191氨基酸功能肽(7个氨基酸)两个功能区与人IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；根据所设计的序列，设计并合成引物F1、F2、R1，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；以延伸反应产物为模板，F1、R1为引物进行PCR反应，得到大小为129bp的制癌肽基因OP。构建制癌肽重组表达质粒pET-SUMO-OP，将重组质粒pET-SUMO-OP进行原核表达，并进行SDS-PAGE鉴定；纯化重组融合蛋白，得到重组制癌肽，该肽具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用。【专利说明】—种重组制癌肽的制备方法
本专利技术属于生物技术药物领域，尤其涉及。
技术介绍
最近有研究发现肿瘤干细胞除了高致瘤性之外，具有很强的迁移能力，并涉及肿瘤转移的形成。最初的微小转移灶发生在血管周围的微环境中，随后，其生长直至出现明显的临床症状需要多种复杂的肿瘤-间质相互作用。整合蛋白是细胞外基质蛋白的细胞表面受体，在包括信号传导、细胞粘附、细胞存活、增殖、迁移、血管形成和基因表达等很多生物行为中起重要作用。最近的研究表明，αν整合蛋白在CSCs中过表达。此外，与定型的起始前列腺癌祖细胞亚型相比，av整合蛋白在前列腺癌CSCs群中表达增高。给予人的a v-siRNA能够显著的抑制骨组织中前列腺癌移植瘤细胞生长，并诱导肿瘤细胞调亡。抗血管生成剂，如JF-10-81，一种喜树碱偶联物，可以减少α V β 3和α V β 5在前列腺癌PC3细胞系中的表达，同时可以阻碍体内肿瘤细胞在血管的粘附和血管生成。总之，抑制αν整合蛋白的功能是一种有希望的靶向CSCs治疗恶性肿瘤的策略。
技术实现思路
本专利技术提供了，旨在提供具有靶向肿瘤干细胞和血管内皮细胞治疗人恶性肿瘤作用的制癌肽。本专利技术的目的在于提供，该制备方法包括以下步骤:步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物Fp F2, R1,以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；步骤三，以延伸反应产物为模板，F。R1为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定；步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET_SUM0_0P表达质粒进行序列分析；步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定；步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。进一步，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列如下:【权利要求】1.，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: 步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计； 步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物Fp F2, R1,以F2为模板，R1为引物进行延伸反应； 步骤三，以延伸反应产物为模板，F1, R1为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定； 步骤四，回收PCR产物，构建重组pET-SUMO-OP表达质粒，并对重组pET-SUM0_0P表达质粒进行序列分析； 步骤五，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定； 步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，设计序列。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据所设计的序列，设计并合成的三条引物。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应的具体 过程为: 在无菌 PCR 管中加入以下试剂:5 μ L F2(10ymol/L),5yL R1 (10 μ mol/L)、16 μ LdNTP(10mmol/L)、10μ L 10 X 连接缓冲液、63 μ L H2O0 94°C孵育 30s，55°C温浴 lOmin，离心5s，加入 IyL Taq 酶，72°C 孵育 5min。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，以延伸产物为模板，F1,R1为引物进行PCR反应的具体过程为: 在无菌PCR管中加入以下试剂:IyL延伸反应液、2 yL F1 (10 μ mol/L)、2 μ LR1 (10 μ mol/L) U μ L dNTP (10mmol/L)、5μ L 10XPCR缓冲液、Taq酶0.2 μ L，最后加双蒸水补足体积至 50 μ L。PCR 循环参数如下-MV 30s, 550C 30s, 72°C 30s, 35cycles, 72°C延伸IOrnin0 用无水乙醇沉淀DNA，12000rpmX IOmin离心，弃除上清液，再用70%乙醇洗涤2次，弃除残余乙醇，TE缓冲液溶解。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三中，产物鉴定的实现方法为: 称取0.75g琼脂糖，加入50mL I X TAE缓冲液； 微波炉加热使琼脂糖溶解，溶液冷却至60°C，加入溴化乙锭至终浓度为0.5 μ g/mL ； 装好电泳槽模具，将胶倒入其内，迅速在模具一侧安插梳子，等凝胶冷却凝固； 小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中； 加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面离于胶面Imm ； 取IyL DNA样品与适量Loading Buffer混匀后加入点样孔中，接通电泳槽和电泳仪的电源，电压调至94V ； 待指示剂迁移至2/3凝胶处，中止电泳； 将胶转移至紫外线透射仪下观察有条带后，再放置在凝胶成像系统上拍照。剩下DNA样品送往上海生物工程技术有限公司测序。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，回收PCR产物的具体过程为: 灌制I %的普通琼脂糖凝胶，在加样孔下方2cm处切一个约1X0.Scm2的小孔，用相应浓度的低熔点凝胶填充，16°C凝固； 在加样孔中加入100 μ L PCR产物后电泳，待样品进入低熔点凝胶中，在310nm的紫外灯下切取目的条带，放入到1.5mL Ep管中称重，按试剂盒说明回收目的DNA; 加 30 μ L Elution Buffer 入回收柱中 37°C静置 2min, 1000Orpm 离心 lmin, Ep 管中液体即为回收的DNA溶液。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将重组pET-SUMO-OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS-PAGE鉴定的具体过程为: 1.用重组pET-SUMO-OP表达质粒转化BL21(DE3)，Kan筛选阳性克隆，挑取单个BL21 (DE3)阳性菌落，于20mL含50 μ g/mL Kan的LB培养基，37°C，180rpm过夜培养； 2.取200μ L过夜菌液转移至20mL含Kan的LB培养基，37°C，200rpm,培养2h左右至对数生长期； 3.加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L，28°C分别诱导2h、4h、6h、8h，各取1.5mL菌液，1000Orpm离心lmin,收集沉淀菌体； 4.各管加入50 μ L 2 X SDS-PAGE Loading Buffer 溶解沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组制癌肽的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：步骤一，根据肿瘤抑素两个功能区和IgG3上游铰链区的序列，进行序列设计；步骤二，根据所设计的序列，设计并合成引物F1、F2、R1，以F2为模板，R1为引物进行延伸反应；步骤三，以延伸反应产物为模板，F1、R1为引物进行PCR反应，并进行产物鉴定；步骤四，回收PCR产物，构建重组pET‑SUMO‑OP表达质粒，并对重组pET‑SUMO‑OP表达质粒进行序列分析；步骤五，将重组pET‑SUMO‑OP质粒在大肠杆菌中表达，并进行SDS‑PAGE鉴定；步骤六，纯化重组融合蛋白，并分析制癌肽空间构象。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹建国，全梅芳，任凯群，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43