针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法技术

本发明专利技术涉及针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，针对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；步骤四：根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。该方法的设计更加系统、全面和高效，能够筛选出最佳抗体对，利用筛选所得抗体对建立的针对待测抗原的ELISA检测方法具有较优的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及生物制品检测领域，具体是指一种可用于所针对待测抗原的定性及定量分析的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法。
技术介绍
酶联免疫吸附检测（ELISA）利用抗原抗体能够专一性结合的性质，早期多被用于抗原定位，现在则多用于抗原的微量检测。目前，基于ELISA技术的定性或定量检测方法已经十分成熟，并且被广泛的应用于各种病毒、病原菌检测，细胞因子检测以及生物大分子药物的药代动力学、免疫原性及活性检测研究等。酶联免疫吸附检测（ELISA）的基本原理是：将待测的抗原或抗体包被在孔板上，酶标记抗体或抗原与相应的包被抗原或抗体结合，在平板上形成免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶可以与相应底物发生显色反应，该显色反应的信号值与包被的待测抗原或抗体的量成一定比例关系，根据信号值强弱可以对待测抗原或抗体进行定性或定量分析。用于显色反应的酶标记化合物可以是碱性磷酸酶、过氧化物酶，也可以是荧光标记或放射性标记等。ELISA酶促显色反应同样能对信号进行放大，实现对待测抗原的微量检测。利用ELISA进行抗原检测时，双抗体夹心法是最常用的。其原理是首先包被捕获抗体，接着加入待测抗原，使其与捕获抗体形成免疫复合物，然后加入酶标检测抗体与待测抗原结合，此时捕获抗体、检测抗体与待测抗原形成双抗体夹心结构。最后根据酶标记选择合适的方式进行显色反应，根据检测信号对待测抗原进行定性或定量分析。很显然，双抗体夹心ELISA方法的核心是选择合适的捕获抗体和检测抗体组成抗体对。这2个抗体分子除了必须满足能够与待测抗原特异性结合，并具有一定的亲和力之外，更重要的还应确保2个抗体分子是针对待测抗原不同的表位（抗原决定簇），比较理想的状态是这2个表位之间有一定的空间距离，就能保证2个抗体分子都能最大程度的与抗原分子结合，使ELISA检测具有较灵敏的检测限和较宽的线性范围。关于ELISA双抗体夹心法检测用抗体对的筛选技术方法的文献资料并不多见，也没有比较系统的报道。这部分工作的开展大多还是停留在常规的“鸟枪法”筛选的阶段：比如将待筛选抗体偶联标记后，两两组合并在某固定的待测抗原浓度条件下进行ELISA检测，考察检测信号，并直接根据检测信号强弱或信噪比对满足要求的抗体对进行筛选。有时候，这种比较直观的筛选方法也能够筛选到一些较优的抗体对，然而却很可能遗失掉最优的，因为这种筛选方法并不完备。比较系统和完备的抗体对筛选方法需要考虑的因素其实有很多，抛开抗体对的实际应用环境不说，依赖于信号值强弱的整个筛选过程还需要考虑筛选时ELISA检测条件、抗体浓度、抗原浓度（待测物）以及抗体偶联标记效率等。抗体浓度需要通过归一化的方式来消除其对信号值的影响，很显然在相互作用未达到饱和的情况下，信号值与所加入的检测抗体的量（浓度）成正相关，不能简单的通过信号值的强弱来对抗体对进行选择，还应该考察检测用的抗体浓度，选择在较低作用浓度下就能得到较高信号值的抗体对。抗原（待测物）浓度在抗体对筛选过程中同样十分重要，最好选在ELISA检测线性段中间点的浓度，相对捕获抗体和检测抗体的用量均不能饱和，因为抗原（待测物）用量过高或过低会使得ELISA检测信号值落在曲线的上平台或下平台区域，变化不明显就难以通过信号值判断抗体对的优劣。抗体偶联标记效率是另一个比较重要的关键因素，因为标记效率直接影响信号强弱，即使抗体作用浓度一致，但若标记效率相差较大，信号值的差异也会十分明显。另一方面，标记效率不同于抗体浓度，是很难直接表征的，一般只能通过质谱的方法来考察每个抗体分子偶联多少个显色基团，事实上即使掌握了标记效率的信息，在实际筛选过程中也是难以根据标记效率来调整检测抗体及捕获抗体的用量的，除非进行多次偶联进行偶联效率的筛选，很显然这种做法是不太科学的。那么如何在抗体对的筛选过程中消除偶联标记效率的影响也是研究人员需要解决的。此外，抗体对筛选过程中，理论上抗体对一旦确定，因为所针对的是抗原的不同表位，这对抗体是可以互为捕获抗体或检测抗体的，但在检测信号方面则可能因为上述原因或其他实验条件而存在不同，这一点同样需要在筛选过程中引起注意。所以，考虑到上述相关因素，提供一种能够排除了筛选过程中捕获/检测抗体量、标记偶联效率以及待测抗原用量的干扰，使筛选过程更加全面和系统的ELISA检测用抗体对的筛选方法是十分必要的，其更有利于生物大分子药物、病毒、病原菌、细胞因子等的定性及定量ELISA检测方法的开发。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服ELISA双抗体夹心检测法检测用抗体对筛选技术方面的缺陷和不足，针对受ELISA检测条件、抗体浓度、抗原浓度（待测物）以及抗体偶联标记效率的干扰影响较大，容易出现选择不全面和误判的问题，提供了一种针对夹心法ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法。为了实现上述目的，在本专利技术提供了一种针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特点是，包括以下步骤：步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记生物素和显色化合物，成为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个标记显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，利用包被亲和素的ELISA板，以所述单个标记生物素抗体分子作为捕获抗体，所述单个标记显色化合物抗体分子作为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；步骤四：根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分子所组成的抗体对的检测信号这一原则，根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。较佳地，所述ELISA检测包括固相反应或液相反应。较佳地，所述待筛选的至少两个抗体分子均为单克隆抗体。较佳地，所述显色化合物为酶标记物、荧光染料、化学发光染料以及放射性标记中的一种。更佳地，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记物或碱性磷酸酶标记物。较佳地，其特征在于，所述待测抗原包括生物大分子药物、病毒、病原菌以及细胞因子。较佳地，其特征在于，所述的采集抗体对检测信号的步骤之后还包括以下步骤：对所述的抗体对检测信号进行归一化处理。本专利技术的有益效果具体在于：能够排除了筛选过程中捕获/检测抗体量、标记偶联效率以及待测抗原用量的干扰，使筛选过程更加全面和系统。基本原理在于：理想的抗体对应该基<本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记生物素和显色化合物，成为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个标记显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，利用包被亲和素的ELISA板，以所述单个标记生物素抗体分子作为捕获抗体，所述单个标记显色化合物抗体分子作为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；步骤四：根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分子所组成的抗体对的检测信号这一原则，根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。

【技术特征摘要】
1.针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记生物素和显色化合物，成为标记生物素
抗体分子和标记显色化合物抗体分子；
步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；
步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述
标记显色化合物抗体分子的单个标记显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，利用包被亲和
素的ELISA板，以所述单个标记生物素抗体分子作为捕获抗体，所述单个标记显色化合物抗
体分子作为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；
步骤四：根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分
子所组成的抗体对的检测信号这一原则，根据所述抗体对检测信号强弱对所述待...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少雄，吕品，
申请(专利权)人：王少雄，吕品，
类型：发明
国别省市：上海;31