基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法，其特征在于：采用甲基叔丁基醚/甲醇/水（MTBE/MeOH/H2O）双相提取，并结合温和碱性水解，提取血浆中鞘脂。随后用超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用在15min内实现快速半定量分析。本发明专利技术中的MTBE/MeOH/H2O提取体系简单，快速，易于操作，提取液中蛋白干扰少，重复性好，同时通过水解除去脂质组中高丰度磷脂和甘油酯的干扰，降低离子抑制，达到高灵敏度检测低丰度鞘脂的目的。后续的超高效液相色谱（UHPLC）的高分辨分离能力和MRM的特异性，可以实现对异构体的有效区分，避免定量时引入复杂的同位素校正，使更快速、准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学和医学领域，是一种基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂的轮廓分析方法。
技术介绍
鞘脂（sphingolipids,SLs）是一类结构中以1,3-羟基-2-氨基烷烃/烯烃为共同母核的脂质分子。随着2-氨基以酰胺键与各种不同链长不同饱和度的脂肪酸相连，以及1-羟基与各类极性基团的相连（如磷酸胆碱、各类简单及复杂糖基等），鞘脂分子结构复杂多样，化学性质不一，同时各亚类鞘脂的丰度也差距很大。尽管鞘脂组是整个脂质组中微小的一部分，其在生命体的功能却不可小觑。鞘脂是构成细胞膜结构的必需组成成分，同时作为信号分子参与细胞凋亡、分化等多个生命过程。鞘脂代谢异常与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、阿尔兹海默症、癌症等多种疾病密切相关。血浆作为常用的生物体液，包含了大量的代谢物信息。因此建立可靠、稳健、简单、高灵敏度的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法对于鞘脂代谢相关的生理、病理研究具有积极的意义。传统的鞘脂分析手段包括薄层色谱（TLC），衍生化后高效液相色谱（HPLC）-紫外/荧光检测，或免疫化学手段。然而这些方法严重受限于检测的特异性，无法在分子水平上实现对鞘脂的准确定量。液相色谱-质谱联用技术是目前理想的用于鞘脂组分析的手段。目前氯仿/甲醇/水体系（CHCl3/MeOH/H2O）提取结合甲醇钠温和碱性水解是提取鞘脂用于HPLC-MS/MS分析的最经典方法。提取全脂直接用于HPLC-MS/MS鞘脂分析的提取方法也多有采用，体系包括氯仿/甲醇/水体系（CHCl3/MeOH/H2O）、正丁醇/水体系（1-butanol/H2O)、异丙醇/乙酸乙酯体系（isopropanol/ethyl acetate）等。相对于前者，这些方法受来自共存高丰度甘油酯（glycerolipids）和甘油磷脂（glycerophospholipids）的离子抑制效应，从而影响检测灵敏度。此外，也有提取出全脂后用固相萃取（SPE）柱对某些亚类鞘脂（如神经酰胺）进行选择性富集的方法，然而该方法操作复杂，通量低。氯仿具有较强的毒性（肝毒性），CHCl3/MeOH/H2O提取体系离心后自上而下分别为水层-蛋白及残渣层-有机层的分布，吸取氯仿层易引入误差，影响提取重复性，且容易在提取液中引入蛋白干扰。在后续的HPLC-MS/MS分析中，多采用正相液相色谱（NPLC），在定量时需要进行同位素校正；一些方法使用反相色谱（RPLC），分离时间长，或引入氯仿作为洗脱流动相。由于鞘脂各亚类在结构和丰度上的多样性，多平台的引入（多个提取+多个LC-MS方法）可以覆盖尽可能多的鞘脂，但会使方法复杂。基于此，我们发展了一种基于液相色谱-质谱联用的血浆鞘脂轮廓分析方法，以期在尽可能简单快速的条件下实现对鞘脂的大规模覆盖。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提供一种基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法，可提供生命体的鞘脂代谢轮廓，用于鞘脂代谢相关的研究，为了解机体的生理过程、疾病的发生发展机制、机体对病变和药物的应答以及个性化治疗方案提供有效的信息和依据。该方法具有灵敏度高、重复性好、特异性好、简单快速，稳健可靠的优点。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：第一步：将低温保存的血浆冰浴下解冻，定量移取40μL，并加入30μL内标混合溶液，涡旋混匀。内标溶液成分和浓度为：Ceramide(d18:1/17:0)0.42nmol/mL，SM(d18:1/12:0)1.67nmol/mL，Sphingosine(d17:1)0.17nmol/mL，Lactosylceramide(d18:1/12:0)0.17nmol/mL，Glucosylceramide(d18:1/12:0)0.03nmol/mL，Dihydroceramide(d18:0/12:0)0.03nmol/mL。第二步：冰浴下加入225μL甲醇和75μL1M的甲醇钠-甲醇溶液，涡旋。加入1mL MTBE，涡旋。第三步：置于37℃摇床上震荡2h。第四步：取出后冷却，加入25μL20%（v/v）乙酸水溶液和250μL超纯水，涡旋。第五步：10℃，转速12000rpm下高速离心10min，定量取出上清800μL，冷冻干燥。第六步，分析前用复溶液甲醇/异丙醇/水=65/30/5（MeOH/IPA/H2O=65/30/5）复溶至50μL，涡旋1min，用于HPLC-MS/MS分析，进样体积为5μL。超高效液相色谱-质谱联用的仪器为LC/MS QQQ6460(Agilent,Santa Clara,CA,USA)液相条件为：色谱柱为UPLC ACQUITYTM C8column(2.1mm×100mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)。流动相为A：乙腈/水=60:40（10mM甲酸铵）；B:异丙醇/乙腈=90:1010mM甲酸铵）。梯度为：0-1.5min，保持B%为32%；1.5-3min，B%从32%线性升至45%；3-11min，B%从45%线性升至75%；11-11.5min，B%从75%线性升至97%，并保持2min；之后0.1min内，B%回到32%并后平衡1.5min。柱温55℃。进样体积5μL。质谱条件为：ESI源正离子模式下，采用动态多反应监测（dynamicMRM）实现对90对离子对（84个内源性鞘脂和6个内标）的同时检测。得到的所有离子对的MRM提取离子色谱图即为血浆鞘脂代谢轮廓谱。质谱采集数据用Masshunter Quantitative Analysis software(Agilent,Santa Clara,CA,USA)导出，并用对应的内标进行校正，实现半定量分析。鞘脂是一类丰度低但具有重要意义的脂质，其含量的变化不仅能反应人体正常情况下的生理状况，同时也能反应外界环境刺激和病变引起的变化。鞘脂的轮廓分析是一种表征鞘脂代谢的方法。采用MTBE/MeOH/H2O双相提取，并结合温和碱性水解提取血浆鞘脂组，利用高分辨高灵敏度LC-MS/MS检测，可以用40μL血浆快速实现对84种鞘脂的半定量分析，从而得到鞘脂的代谢轮廓信息。本专利技术中所改进的鞘脂提取方法相对于其他提取方法，操作更为简单快速，溶剂毒性小，提取过程中不会引入蛋白干扰，重复性好。同时水解本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于液相色谱‑质谱联用的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法，其特征在于：第一步，将低温保存的血浆冰浴下解冻，定量移取并加入内标溶液，涡旋混匀；第二步，冰浴下加入甲醇和甲醇钠‑甲醇（MeONa‑MeOH）溶液，涡旋；加入MTBE，涡旋；第三步，置于摇床上震荡；第四步，取出后冷却至室温，加入乙酸水溶液和纯水，涡旋；第五步，高速离心后定量取出上清，冷冻干燥；第六步，分析前用复溶液复溶，涡旋，用于超高效反相液相色谱‑质谱分析。

【技术特征摘要】
1.基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂轮廓分析方法，其特征
在于：
第一步，将低温保存的血浆冰浴下解冻，定量移取并加入内标溶液，
涡旋混匀；
第二步，冰浴下加入甲醇和甲醇钠-甲醇（MeONa-MeOH）溶液，涡旋；
加入MTBE，涡旋；
第三步，置于摇床上震荡；
第四步，取出后冷却至室温，加入乙酸水溶液和纯水，涡旋；
第五步，高速离心后定量取出上清，冷冻干燥；
第六步，分析前用复溶液复溶，涡旋，用于超高效反相液相色谱-质谱
分析。
2.根据权利要求1所述的基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆鞘脂轮
廓分析方法，其特征在于，第一步中，所用血浆体积为40μL，加入内标混
合液30μL，内标包括：Ceramide(d18:1/17:0)0.42nmol/mL，SM(d18:1/12:0)
1.67nmol/mL，Sphingosine(d17:1)0.17nmol/mL，
Lactosylceramide(d18:1/12:0)0.17nmol/mL，Glucosylceramide(d18:1/12:0)
0.03nmol/mL，Dihydroceramide(d18:0/12:0)0.03nmol/mL。
3.根据权利要求1所述基于液相色谱-质谱联用的大规模...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，李佳，赵欣捷，路鑫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21