一种快速提取百合鳞茎DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种植物基因组提取方法，公开了一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，包括新鲜百合鳞茎样品研磨、加入预冷的预处理液去除杂质、加入预热的裂解液进行裂解、用氯仿和乙醇和异戊醇的混合溶液去除蛋白、用70%乙醇去除残留醇类物质和用TE溶液溶解保存DNA步骤。本方法能快速、简便、高效提取百合鳞茎中的完整基因组DNA，操作难度低，不受次生代谢物的污染，提取的DNA可以用于分子生物学分析，从而为百合的遗传多样性分析、种质资源保护和利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物基因组提取方法，尤其涉及了一种快速提取百合鳞茎DNA的方法。 
技术介绍
百合（Lilium.）为百合科百合属多年生草本球根植物，是世界上重要花卉品种之一，被誉为“球根花卉之王”，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，全球发现的品种达百种，其中我国是最主要的起源地，自然分布品种就有50多种。随着植物分子生物学研究的不断进步，分子生物技术已被广泛应用于植物资源鉴定、植物选种、育种和遗传改良等方面，而高质量DNA的提取是进行分子生物实验的基础。基因工程育种将是未来百合育种的主要研究方向和科研工作的重点，而任何一项基因工程技术均离不开DNA的提取和操作。 百合的鳞茎中富含多糖、酚、色素及多种次生代谢物质，百合中分离获得的DNA由于富含多酚，易被氧化成棕褐色，此外，由于多糖、单宁等物质与DNA的理化性质相似会结合成粘稠的胶状物，很难将其分离，因此，获得的DNA产量低、质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能进行酶切及作为模板进行试验。 目前对的植物叶片和罗布麻属植物的基因组DNA提取方法，均通过液氮冷冻研磨法，但该方法不适用于百合鳞茎的DNA提取；而水稻和香菇的快速DNA提取方法具有严格的植物针对性，提取质量较差。由于百合的鳞茎生长有其特殊性，如其鳞茎组织糖分及次生代谢物含量较高，如方法不当极易造成基因组 DNA的褐化而影响DNA的提取效果；且普通的DNA提取方法多采用液氮研磨法进行植物的细胞破碎，而百合鳞茎水分含量很高会导致研磨组织冻结，无法进行研磨，但如采用直接研磨匀浆的方法，则又会使DNA大量降解而且细胞内各种降解酶被释放，提取DNA含量和质量均会受到极大影响，上述方法均不利于百合鳞茎DNA快速高效提取。 
技术实现思路
本专利技术针对百合鳞茎的基因组DNA提取中，DNA易褐化，鳞片水分含量高不易细胞破碎、提取液糖分含量高、单位体积提取量低等缺点，提供了一种快速、高效，糖分含量低、且成本低廉，操作简便，适于提取百合鳞茎基因组DNA的方法。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决： 一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，包括如下步骤： （1）取80～120mg新鲜百合鳞茎样品,放入离心管内，加入预冷的预处理液600～1000uL室温放置5～10min，4500～5500rpm离心5～8min，弃上清液； （2）向步骤（1）的离心沉淀物中迅速加入预热的CTAB提取缓冲液600～800ul，混合均匀，于60～65℃水浴40～50min； （3）向步骤（2）的混合物中加入400～500uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于8000～12000rpm离心6～10min，留上清液； （4）向步骤（3）的上清液中加入占上清液0.6～0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置10～20分钟，离心，弃上清； （5）用预冷的70%的乙醇漂洗步骤（4）的离心沉淀物，室温干燥，加入 180～220uL1×TE溶液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。 采用本专利技术的方法提取百合鳞茎DNA，无需液氮研磨，先在前期组织破碎阶段加入了DNA保护缓冲液，不仅能解决常规鳞片含水量高，遇液氮无法研磨的问题，更能去除部分可溶性多糖，本方法省时省力。另外缩短离心时间和降低离心速度，可以减少多糖等杂质与DNA一起被沉淀，百合基因组DNA提取效果好，时间短，容易操作。 作为优选，步骤（1）加入预处理液前还需要将百合样品打磨成匀浆。直接将新鲜百合鳞茎打磨成泥状，再进行DNA提取操作，解决了鳞茎鲜品遇液氮后坚硬难以研磨的问题。 作为优选，步骤（1）预处理液预冷处理温度为0～4℃。 作为优选，步骤（1）中，预处理液为pH值为8.0的10mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的1mmol/LEDTA和0.1mol/L的NaCl的缓冲液，预处理液经过灭菌处理，灭菌温度为120℃，灭菌时间为20min。 作为优选，步骤（2）中，CTAB提取缓冲液为pH值为8.0的100mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的20mmol/L的EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为2%CTAB、质量分数为2%α-巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液。其中，EDTA为乙二胺四乙酸，CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，PVP为聚乙烯吡咯烷酮。 作为优选，步骤（2）中，CTAB提取缓冲液预热处理温度为60～70℃。 作为优选，步骤（4）中，冰冻温度为-22～-18℃。 本专利技术由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果： （1）采用本申请的快速提取百合鳞茎DNA的方法，无需液氮研磨，在前期组织破碎阶段加入了DNA保护缓冲液，不仅能解决常规鳞片含水量高，遇液 氮无法研磨的问题，更能去除部分可溶性多糖，方法省时省力。 （2）本申请缩短了离心时间并降低了离心速度，可以减少多糖等杂质与DNA一起被沉淀，提取出的DNA经琼脂糖凝胶电泳显示清晰完整的基因组DNA条带，经分光光度计检测A260/280值为1.75～1.90。 （3）本申请中采用氯仿和乙醇和异戊醇的混合液为抽提液，采用醋酸钠溶液增加DNA溶解度，并采用用70%乙醇去除残留醇类物质，反应均匀且充分，反应时间短，溶液中物质充分分层，能有效去除蛋白和多糖等杂质。 附图说明图1是采用本专利技术的方法提取出的百合鳞茎DNA的电泳图； 图2是采用本专利技术的方法提取出的DNA扩增ITS序列、matK基因和RbcL基因的电泳图。 具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步详细描述。 实施例1 样本来源：2012年11月采集于浙江省绍兴地区的东方百合“Siberia”种球鳞茎，成品种球直径14-16cm。 一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： （1）取100mg新鲜百合鳞茎样品,打磨成匀浆，放入离心管内，加入预冷的0℃的预处理液800uL，室温放置8min，5000rpm离心5min，弃上清液，其中，预处理液为pH值为8.0的10mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的1mmol/LEDTA和0.1mol/LNaCl的缓冲液，120℃灭菌20min； （2）向步骤（1）的离心沉淀物中迅速加入预热至65℃的CTAB提取缓冲液700ul，混合均匀，于62℃水浴45min，其中CTAB提取缓冲液为pH值为8.0 的100mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的20mmol/L的EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为2%CTAB、质量分数为2%α-巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液； （3）向步骤（2）的混合物中加入450uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于10000rpm离心8min，留上清液； （4）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取80～120mg新鲜百合鳞茎样品,放入离心管内，加入预冷的预处理液600～1000uL室温放置5～10min，4500～5500rpm离心5～8min，弃上清液；（2）向步骤（1）的离心沉淀物中迅速加入预热的CTAB提取缓冲液600～800ul，混合均匀，于60～65℃水浴40～50min；（3）向步骤（2）的混合物中加入400～500uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于8000～12000rpm离心6～10min，留上清液；（4）向步骤（3）的上清液中加入0.6～0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置10～20分钟，离心，弃上清；（5）用预冷70%的乙醇漂洗步骤（4）的离心沉淀物，室温干燥，加入180～220uL1×TE溶液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。

【技术特征摘要】
1.一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取80～120mg新鲜百合鳞茎样品,放入离心管内，加入预冷的预处理液
600～1000uL室温放置5～10min，4500～5500rpm离心5～8min，弃上清液；
（2）向步骤（1）的离心沉淀物中迅速加入预热的CTAB提取缓冲液600～800ul，
混合均匀，于60～65℃水浴40～50min；
（3）向步骤（2）的混合物中加入400～500uL的抽提液，抽提液为体积比为
76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于8000～12000rpm
离心6～10min，留上清液；
（4）向步骤（3）的上清液中加入0.6～0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后
在冰冻条件下放置10～20分钟，离心，弃上清；
（5）用预冷70%的乙醇漂洗步骤（4）的离心沉淀物，室温干燥，加入180～220uL
1×TE溶液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。
2.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于：步
骤（1）加入预处理液前还需要将百合样品打磨成匀浆。
3.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超，郭方其，黎侠，丁晓瑜，林森洪，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33