本发明专利技术涉及基于核酸序列的存在的检测和鉴定STEC细菌的快速方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。这个方法优选地用于检测食物或水样品中，诸如牛肉富集物中的STEC细菌。本发明专利技术还涉及用于实施本发明专利技术的方法的分离的多核苷酸、复制组合物、试剂盒和试剂片。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及基于核酸序列的存在的检测和鉴定STEC细菌的快速方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。这个方法优选地用于检测食物或水样品中，诸如牛肉富集物中的STEC细菌。本专利技术还涉及用于实施本专利技术的方法的分离的多核苷酸、复制组合物、试剂盒和试剂片。【专利说明】用于STEC细菌的检测和鉴定的序列以及它们的使用
本专利技术涉及基于核酸序列的存在检测和鉴定产志贺毒素大肠杆菌(Escherichiacoli)的方法，优选基于PCR的检测方法，以及涉及寡核苷酸分子及用于其的试剂和试剂盒。
技术介绍
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性、杆状细菌。虽然大多数大肠杆菌(E.coli)的菌株是良性的，并且被发现是人和其他动物的肠道正常菌群，但一些菌株是致病的并且能够导致疾病。不同的致病大肠杆菌(E.coli)菌株在流行病学，临床病程和导致疾病爆发的潜力方面是不同的。产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli) (STEC)是一种肠出血性大肠细菌,其可引起轻度至严重的肠道疾病，肾脏问题，甚至中枢神经系统效应。这些菌株的致病性是由于，在很大程度上，其产生的志贺样毒素Stxl和Stx2。另外，由eae基因编码的紧密黏附素粘附蛋白的生成已被证实与细菌的致病性有关，因为其具有某种表面抗原，包括026、0111、0121、045、0103、和 0145 抗原。一种熟知的STEC细菌血清型是大肠杆菌(E.coli)血清型0157:H7，其已经与多起食物和水传播的爆发相关。美国农业部以零容忍标准控制这种细菌血清型作为碎牛肉中的掺杂物。由于其严格的监管，市场上存在众多针对大肠杆菌(E.coli) 0157:H7的测试。然而，众多其他STEC细菌菌株也能致病，对其他STEC细菌血清型，或一般来讲STEC细菌的检测对于改善食品安全是很重要的。因此，期望用于样品中STEC细菌的准确检测和鉴定的测试。
技术实现思路
本专利技术的一个方面是检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括:(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含适宜的引物对用于扩增eae基因、StxlA基因和Stx2A基因中的一个或多个的至少一部分；(b)使用步骤(a)的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤(b)的所述扩增。在某些例子中，本专利技术涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括:(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:688 (eae)的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5’末端和3’末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 145或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；并且其中所述探针包含SEQ ID NO: 160或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；(b)使用步骤(a)的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤(b)的所述扩增。在某些实施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO: 191或其互补序列的至少15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，所述第一引物包含选自SEQID NOs: 146-159的序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 192-205的序列，并且所述探针包含选自SEQ ID NOs: 161-175的序列。在附加的实施例中，所述探针的3’末端直接或间接连接到所述引物的5’末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO: 176的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。在其他例子中，本专利技术涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括:(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:686(StxlA)的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探针选自:(I)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及其包含SEQ ID NO: 16或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；(II)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:49或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；以及(III)包含SEQ ID NO:55或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID N0:56或其互补序列的探针；(b)使用步骤(a)的所述反应混`合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤(b)的所述扩增。在某些实施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO:58的至少15个连续的核苷酸或包含SEQ ID N0:73。在其他的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:2-15，48的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:59-72的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID NOs: 17-30,49-52的序列。在另外的实施例中，所述探针的3’末端直接或间接连接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID N0:53、54或57，或包含SEQ ID NO: 31的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。在进一步的例子中，本专利技术涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:687(Stx2A)的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探针选自:(I)包含SEQ ID N0:74或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:89或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；(II)包含SEQ ID NO: 120或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 121或122或其互补序列的探针；以及(III)包含SEQ ID NO: 125或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 126或其互补序列的探针；(b)使用步骤(a)的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤(b)的扩增。在某些实施例中，所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 128的至少15个连续的核苷酸或包含SEQ ID NO: 143或144。在其他的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:75-88的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 129-144的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:688的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO:145或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；并且其中所述探针包含SEQ ID NO:160或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤（b）的所述扩增。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S瓦基，DR德马科，MA詹森，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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