一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML和结合态CML的检测前处理；游离态CML检测前处理：取样，添加甲醇溶液稀释，漩涡混匀，C18固相萃取柱净化，加甲醇溶液洗脱，经微滤膜过滤后制得待测样品1；结合态CML检测前处理：取样，硼氢化钠还原，透析袋分离多肽及蛋白，盐酸水解，真空除酸，C18固相萃取柱净化，微滤膜过滤，真空干燥，复溶后制得待测样品2；接着，对待测样品1和2分别进行CML检测；CML总含量为游离态CML与结合态CML含量的加和。本发明专利技术样品前处理方法，具有排除干扰、保护色谱柱、安全可靠、能完整分析酱油中全部CML等特点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML和结合态CML的检测前处理；游离态CML检测前处理：取样，添加甲醇溶液稀释，漩涡混匀，C18固相萃取柱净化，加甲醇溶液洗脱，经微滤膜过滤后制得待测样品1；结合态CML检测前处理：取样，硼氢化钠还原，透析袋分离多肽及蛋白，盐酸水解，真空除酸，C18固相萃取柱净化，微滤膜过滤，真空干燥，复溶后制得待测样品2；接着，对待测样品1和2分别进行CML检测；CML总含量为游离态CML与结合态CML含量的加和。本专利技术样品前处理方法，具有排除干扰、保护色谱柱、安全可靠、能完整分析酱油中全部CML等特点。【专利说明】
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种检测食品中羧甲基赖氨酸(CML)的方法，尤其适用于酱油中CML含量的检测，体系中CML的总含量为游离态CML与结合态CML含量的加和。
技术介绍
CML是食品和生物体中由美拉德反应产生的高度氧化的化合物，此外，还可由糖氧化、脂质氧化中间产物经复杂变化产生，分为游离态CML (糖基化氨基酸)和结合态CML (糖基化多肽及蛋白质)。现有研究表明，食源性CML可能与肾衰竭、糖尿病、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化、老年痴呆症等疾病的恶化有关，其中游离态CML对人体的危害更大。酱油是由大豆、小麦、水、盐等原料经长期发酵制得的调味品，体系中富含蛋白质及碳水化合物，长期的发酵过程可能使其含有大量的CML，对人体健康造成潜在危害。已报道的CML检测方法主要有:ELISA、HPLC、GC-MS、LC-MS等。ELISA是CML检测最为简便、快速的方法，但由于在复杂的食品体系中，该技术特异性差、抗干扰能力差，因而其检测结果备受质疑；HPLC和GC-MS技术分别需要对待测样本进行荧光性和挥发性衍生处理，该过程耗时、操作复杂且会降低检测灵敏度；LC-MS技术由于其高特异性、可靠性、可直接检测不需衍生化处理等特性，被认为是CML检测的最优技术。为了确保检测结果的准确性以及保护液-质系统，食品样品使用LC-MS进行CML检测前通常需要经过适当的前处理。目前还未有完善的酱油中CML检测的前处理方法。已报道的液-质联用检测食品中CML的前处理方法主要为:取样、硼氢化钠还原、三氯乙酸(TCA)沉淀分离蛋白、蛋白盐酸水解、干燥、复溶制得待测样品。中国专利文献CN103293243A公开了一种食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，并具体公开了脱脂、TCA沉淀分离蛋白、蛋白质盐酸水解、FMOC-CL衍生、浓缩、溶解的前处理步骤。但是，酱油中总氮45%存在于低分子量多肽(l_5kDa)中，45%存在于游离氨基酸中，上述TCA法不能完全沉淀分离低分子量多肽(糖基化多肽)，且无法沉淀分离游离氨基酸(糖基化氨基酸)，故无法完整得到酱油体系中总的CML含量，严重影响检测结果的准确性和可靠性。现在还没有专门针对酱油中游离态CML检测的前处理方法，也没有将透析法应用到酱油中结合态CML检测前处理技术中的报道。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供一种酱油中CML的定量检测方法；将酱油体系中CML的检测前处理分为游离态CML和结合态CML两部分，可准确地获得酱油中CML的完整含量。其中游离态CML检测前处理可有效除去体系中大分子杂质及色素，具有防止污染色谱柱、延长色谱柱使用寿命等特点；结合态CML检测前处理可完全分离酱油体系中蛋白质及多肽，具有可完整分析酱油中总的结合态CML含量的特点。本专利技术的目的通过以下技术方案实现:—种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML的检测前处理和结合态CML的检测前处理；所述游离态CML的检测前处理方法的具体步骤如下:(I)向酱油样品中加甲醇溶液稀释，漩涡混匀；(2)取上述稀释液使用C18固相萃取柱净化，加入甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述每ImL稀释液对应甲醇溶液的添加量为5-8mL ；(3)将所述洗脱液经微滤膜处理，得到所需待测样品I ;所述结合态CML的检测前处理方法的具体步骤如下:(I)向酱油样品中加入硼酸缓冲液及硼氢化钠溶液进行还原处理，所述酱油取样量为3-7.5mg肽态氮含量当量；(2)将还原后的样品于4°C条件下，采用截留分子量为500_1000Da的透析袋，每隔24h更换一次透析袋外液体，静置透析5-7d ；(3)取透析袋内液体，加12mol/L的HCl使体系中HCl的浓度达到6mol/L，然后在110°C下水解12?16h ；(4)真空干燥除酸，加蒸馏水复溶，使用C18固相萃取柱净化，加5_8mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；(5)将所述洗脱液经微滤膜处理，干燥、加100?300 μ L甲醇溶液复溶后制得待测样品2 ；然后，将经过前处理的待测样品I和2分别进行CML检测。所述游离态CML的检测前处理方法中步骤(1)，甲醇溶液的体积浓度为10%，稀释倍数为100倍。所述游离态CML的检测前处理方法中步骤(2)，所述C18固相萃取柱使用前经3mL无水甲醇活化处理。所述游离态CML的检测前处理方法中步骤(2)，甲醇溶液的体积浓度为10%。所述游离态CML的检测前处理方法中步骤(3)，所述微滤膜孔径为0.22 μ m。所述结合态CML的检测前处理方法中步骤(1)，所述硼酸缓冲液(0.5mol/L, pH9.2)添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，所述硼氢化钠溶液(2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.lmol/L的氢氧化钠溶液)添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.lmol/L。所述结合态CML的检测前处理方法中步骤(4)，所述C18固相萃取柱(2000mg/12mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司)使用前经3mL无水甲醇活化处理，甲醇溶液的体积浓度为10%。所述结合态CML的检测前处理方法中步骤(5)，所述微滤膜孔径为0.22 μ m。所述结合态CML的检测前处理方法中复溶步骤，甲醇溶液的体积浓度为10%。所述CML检测采用高效液相色谱-质谱。所述高效液相色谱采用Watersl525机型,检测条件为:色谱柱:WatersAtlantis C18 色谱柱 4.6 X 150mm, 5 μ m柱温:30°C流动相:甲醇:水=1:9流速:0.5mL/min进样量:IOyL;质谱为单重四级杆质谱,采用机型为Waters Micromass ZQ,检测条件为:离子源:ESI+毛细管电压:3.0kV锥孔电压:20V离子源温度:100 °C脱溶温度:300°C扫描模式:单离子记录CML 质荷比:205 (M+)。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果:(I)本专利技术全面考虑酱油中游离态CML与结合态CML的含量，按照酱油样本的特性将其所含游离态CML、结合态CML分别提取、纯化，可准确获得酱油中总的CML含量。(2)本专利技术所述的酱油中游离态CML的检测前处理方法，采用C18固相萃取柱进行净化处理，能够除去待测样品中本身含有的蛋白质分子、脂肪分子以及与CML分子量相近的干扰分子，同时由于C18是非极性吸附剂，而目标分子CML是极性分子，使用C18固相萃取柱对样品进行净化处理，在吸附样品中杂质分子的同时，避免对目标分子的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML的检测前处理和结合态CML的检测前处理；所述游离态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：（1）向酱油样品中加甲醇溶液稀释，漩涡混匀；（2）取上述稀释液使用C18固相萃取柱净化，加入甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述每1mL稀释液对应甲醇溶液的添加量为5‑8mL；（3）将所述洗脱液经微滤膜处理，得到所需待测样品1；所述结合态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：（1）向酱油样品中加入硼酸缓冲液及硼氢化钠溶液进行还原处理，所述酱油取样量为3‑7.5mg肽态氮含量当量；（2）将还原后的样品于4℃条件下，采用截留分子量为500‑1000Da的透析袋，每隔24h更换一次透析袋外液体，静置透析5‑7d；（3）取透析袋内液体，加12mol/L的HCl使体系中HCl的浓度达到6mol/L，然后在110℃下水解12～16h；（4）真空干燥除酸，加蒸馏水复溶，使用C18固相萃取柱净化，加5‑8mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；（5）将所述洗脱液经微滤膜处理，干燥、加100～300μL甲醇溶液复溶后制得待测样品2；然后，将经过前处理的待测样品1和2分别进行CML检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李琳，李玉婷，李冰，苏健裕，徐振波，卞华伟，梁志理，
申请(专利权)人：华南理工大学，中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44