一种LKB1蛋白检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种LKB1蛋白检测方法，包括以下步骤：制备LKB1单克隆抗体；用量子点标记LKB1单克隆抗体，得到量子点LKB1单克隆抗体；用量子点LKB1单克隆抗体与标本反应；将反应后的标本置于显微镜下观察。本发明专利技术还提供了含有量子点LKB1单克隆抗体的检测试剂盒。本发明专利技术的检测方法以量子点LKB1单克隆抗体作为探针，与LKB1蛋白结合的特异性增强，毒性减小使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；操作简单、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种LKB1蛋白检测方法，包括以下步骤：制备LKB1单克隆抗体；用量子点标记LKB1单克隆抗体，得到量子点LKB1单克隆抗体；用量子点LKB1单克隆抗体与标本反应；将反应后的标本置于显微镜下观察。本专利技术还提供了含有量子点LKB1单克隆抗体的检测试剂盒。本专利技术的检测方法以量子点LKB1单克隆抗体作为探针，与LKB1蛋白结合的特异性增强，毒性减小使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；操作简单、灵敏度高。【专利说明】—种LKB1蛋白检测方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种LKBl蛋白检测方法及试剂盒。
技术介绍
人LKBl (Liver Kinase BI)基因或称 STKll (Serine-Threonine kinase 11)基因，定位于人染色体19pl3.3位置，含10个外显子，编码的LKBl蛋白由433个氨基酸组成，分子量约为50kDa，包括激酶区域(44-309)、N端调节域和C端调节域。N端调节域含一个核定位序列，使LKBl蛋白定位于细胞核内。LKBl基因编码一种丝-苏氨酸蛋白激酶，参与多种生物学过程，包括细胞周期阻滞、P53介导的凋亡、细胞极性诱导等，介导TGF-β、G蛋白偶联等信号通路，在细胞生长、分化调控中发挥着重要作用，几乎在人体多种组织中均有表达，以上皮、睾丸生精小管、肝脏、小肠和骨骼肌最多。LKBl基因是肿瘤易患综合症，即PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome, PJS)的致病基因，在高达90%的PJS病人中可检测到LKBl基因的胚系突变。LKBl基因的功能异常还与全身多种散发性肿瘤的发生密切相关，如在30-40%的非小细胞肺癌、20%的宫颈癌、19%鳞状细胞癌及13%乳腺侵润性导管癌中均有LKBl基因的失活。另外，LKBl基因在恶性肿瘤发生中起着重要作用，已有研究证实LKBl能够使细胞周期停滞在Gl期，抑制细胞生长。LKBl基因是一个较为普遍的抑癌基因。LKBl基因表达情况对肿瘤发生和预后影响都是一个重要的中间指标，对揭示LKBl基因抑制细胞恶性增殖的分子背景有重要的意义，因此，LKBl基因表达情况的检测，即LKBl蛋白水平检测或LKBlmRNA的水平检测是亟待解决的问题。目前，LKBl蛋白的检测方法主要为免疫组织化学法，一种现有技术利用兔源多克隆抗体作为一抗，然后用标记了化学显色试剂或者荧光基团的二抗对一抗进行标记，一抗与LKBl蛋白结合后再用化学显色试剂的颜色或者荧光基团的荧光信号来判断LKBl蛋白的丰度。这种间接的检测方法步骤繁琐耗时长，并且由于多克隆抗体的特异性不强导致非特异性信号的产生，对检测结果的准确性有很大影响。还有一种现有技术是利用DAB显色的原理，对LKBl鼠源单克隆抗体进行显色标记，然后LKBl抗原免疫组化染色，再用光学显微镜观察，出现棕黄色或棕褐色的为阳性，综合考虑阳性细胞着色深浅和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。这种方法中使用的DAB染色剂有毒性，为疑似致癌物质，不安全，另外，显色剂显色反应受温度影响大，且显色时间受到限制，不能长期保存，实验人员无法将组织切片保存进行重复观察。量子点具有宽的激发光谱和窄的发射光谱(光谱宽在20_40nm之间)，通过改变量子点的尺寸或者改变量子点内核的组分可以在很大范围内调节量子点的发射光谱。量子点与有机荧光团相比有几个突出的光学特点:窄的发射光谱能减少光谱重叠，从而能同时区别多个荧光团；宽的激发光谱能在单一波长下激发多种颜色的光谱。此外量子点具有光稳定性和抗降解性，对细胞的毒性小。这些独特的光学性质使量子点能在体内跟踪多个细胞和制备体外多个分子生物传感器，而且由于量子点的可调谐的发光波长，使量子点能促进组织深层的细胞成像。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种LKBl蛋白检测方法，包括以下步骤:用量子点标记LKBl单克隆抗体，得到量子点LKBl单克隆抗体；用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应；将反应后的标本置于显微镜下观察，其中，所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。优选地，所述的用量子点标记LKBl单克隆抗体包括以下步骤:将量子点表面用GHS进行修饰，得到GSH-量子点；在GSH-量子点中加入SMCC，形成SMCC-GHS-量子点；将SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。优选地，所述的将量子点表面用GHS进行修饰为:将量子点加入到GHS中进行反应,得到第一反应液；将第一反应液离心，收集沉淀；将所得沉淀用potassium t-butoxide溶液溶解,得到第二液体；将第二液体透析，去除第二液体中的GSH与potassium t-butoxide,得到GSH-量子点。优选地，所述的SMCC-GHS-量子点的制备方法为:将GSH-量子点与sulfo-SMCC水溶液混合反应，得到第三反应液；在第三反应液中加入巯基乙醇，得到第四反应液；将第四反应液进行层析，得到第五反应液，再将层析后得到的第五反应液离心，离心所得沉淀重新溶解，得到SMCC-GHS-量子点。优选地，所述的SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应为:LKBl单克隆抗体中加入DTT溶液进行还原，得到还原的LKBl单克隆抗体；将SMCC-GHS-量子点与还原的LKBl单克隆抗体混合反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。优选地，所述的用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应包括以下步骤:将标本用固定液进行固定；用洗涤液冲洗固定后的标本；过氧化氢处理标本；封闭液处理标本；将量子点LKBl单克隆抗体与标本进行反应。本专利技术还提供了 LKBl蛋白检测试剂盒，包括量子点LKBl单克隆抗体。优选地，还包括固定液和洗涤液。优选地，还包括封闭液。优选地，还包括过氧化氢。优选地，还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为过表达LKBl蛋白的细胞，所述的阴性对照品为LKBl表达沉默的细胞。优选地，所述的固定液选自戊二醛、多聚甲醛、乙醇、甲醇或丙酮。优选地，所述的洗涤液为PBS溶液。优选地，所述的封闭液为正常山羊血清。本专利技术的LKBl蛋白检测方法利用抗原抗体特异性结合的原理，以量子点LKBl单克隆抗体作为探针与抗原(LKB1蛋白)结合，利用量子点发出的荧光对LKBl蛋白进行定位、定性及定量研究。细胞样品或组织样本被制成标本后，加入量子点LKBl单克隆抗体反应，将反应后的标本置于荧光显微镜下观察。LKBl蛋白与量子点LKBl单克隆抗体特异性的结合后，LKBl蛋白发出荧光，能够发出荧光的细胞为阳性细胞，不能发出荧光的为阴性细胞，还可通过综合考虑阳性细胞荧光强度和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。本专利技术的有益效果在于，本专利技术的检测方法以量子点LKB I单克隆抗体作为探针，与LKB I蛋白结合的特异性增强，毒性减小使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；本专利技术的检测方法的有益效果还在于操作简单、灵敏度高。【专利附图】【附图说明】图1是荧光显微镜下乳腺癌细胞BT474涂片图。图2是荧光显微镜下胃癌细胞BG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种LKB1蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤：用量子点标记LKB1单克隆抗体，得到量子点LKB1单克隆抗体；用量子点LKB1单克隆抗体与标本反应；将反应后的标本置于显微镜下观察，其中，所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，王伟，粟武，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44