本发明专利技术提供一种IPV皮内免疫有效性评价用动物模型的建立方法，选择猪龄为3-5个月、体重为10-20kg的属于华南型猪种的云南版纳小耳猪，随机分组，分别进行第一次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后30天采血，分离血清，再分别进行第二次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后7天和30天采血，分离血清，再分别进行第三次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后1个月、6个月、12个月、18个月和24个月采血，分离血清，将各血清于56℃灭活30分钟，用常规稀释后，用Sabin株I型、Ⅱ型和Pfizer株III型病毒中和各血清，病毒用量为30～300TCID50，在35～37℃下中和3小时，加入细胞，于35～36℃培育7天后，根据CPE判定结果，即建立起IPV皮内免疫有效性评价用动物模型。为疫苗的皮内免疫研究提供了一种理性动物模型，可为研究皮内免疫途径减少疫苗抗原用量提供可靠手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种IPV皮内免疫有效性评价用动物模型的建立方法，选择猪龄为3-5个月、体重为10-20kg的属于华南型猪种的云南版纳小耳猪，随机分组，分别进行第一次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后30天采血，分离血清，再分别进行第二次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后7天和30天采血，分离血清，再分别进行第三次无针皮内注射IPV疫苗免疫，免疫后1个月、6个月、12个月、18个月和24个月采血，分离血清，将各血清于56℃灭活30分钟，用常规稀释后，用Sabin株I型、Ⅱ型和Pfizer株III型病毒中和各血清，病毒用量为30～300TCID50，在35～37℃下中和3小时，加入细胞，于35～36℃培育7天后，根据CPE判定结果，即建立起IPV皮内免疫有效性评价用动物模型。为疫苗的皮内免疫研究提供了一种理性动物模型，可为研究皮内免疫途径减少疫苗抗原用量提供可靠手段。【专利说明】IPV皮内免疫有效性评价用动物模型的建立方法
本专利技术涉及疫苗皮内安全性和免疫原性评价用动物模型的建立方法，特别是一种脊髓灰质炎灭活疫苗皮内免疫评价用小型猪动物模型的建立方法，属医学生物
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技术介绍
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒1、π、ιπ型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状会迅速引起不可逆转的瘫痪，引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹，多发生于小儿，因此又称为“小儿麻痹症”。50年代中后期，美国的两位科学家Dr.Jonas Salk和Dr.Albert Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(0PV)，给人们预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力的武器。脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)在中国消灭脊髓灰质炎的过程中发挥了重要作用，但脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)会增加疫苗相关麻痹(VAPP)和疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)感染病例的风险。随着全球消灭脊髓灰质炎的推进，2013年第66界世界卫生大会计划在2018年实现全球消灭脊灰的宏伟目标，因此在消灭脊髓灰质炎的最后阶段，只有使用脊髓灰质炎灭活疫苗IPV代替脊髓灰质炎减毒活疫苗OPV才能最终根除脊髓灰质炎。世界卫生大会提出研发全球可负担得起的IPV的目标，使任何中等收入和低收入的国家都能用上IPV，解决后脊髓灰质炎时代疫苗的供应和安全使用等问题。但由于 脊髓灰质炎灭活疫苗IPV的抗原用量是脊髓灰质炎减毒活疫苗OPV的100-300倍，为使全球都能用上IPV，一般采取的策略包括:1.采用皮内免疫减少每剂的抗原使用量(IDD) ;2.运用佐剂，使每剂的抗原含量降低；3.改变免疫程序，减少免疫次数；4.使用联合疫苗；5.优化生产工艺，扩大产能；6.用基于减毒株(Sabin)来生产IPV，生物安全要求低，降低生产成本。因此，建立IPV皮内注射免疫效果的评价模型和方法，对减少抗原用量具有重要的意义。传统的IPV是通过肌肉注射途径进行免疫的，肌细胞对抗原的摄取机理主要是通过抗原进入肌组织后，在肌纤维外间质内扩散，影响扩散的主要屏障是肌束膜。与肌肉注射相比，皮内注射具有很多参与抗原提呈的细胞，通常只需极少量的抗原即可诱发长时间的保护性免疫。皮内接种途径(IDD)首先靶向于位于真皮较深处的抗原提呈细胞一树突状细胞(DC)，DC可直接激活T细胞，提呈于DC膜表面丰富的抗原肽一 MHC I类分子复合物、抗原肽一 MHC II类分子复合物，为相应的CD8+、CD4+T细胞的结合提供了分子基础。DC除了为T细胞提供抗原肽一 MHC分子复合物这一抗原信号(第一信号)外，还高表达⑶80、CD86.CD40等辅助刺激分子，为T细胞提供了充分的第二信号。DC捕获并处理抗原后与一MHC I/II类分子共表达于细胞表面，随后通过引流淋巴管迁移至局部淋巴结，在迁移的过程中DC细胞经历了功能的成熟，失去处理抗原以及摄取免疫刺激的能力，准备被初级T细胞受体以及特异性B细胞前体所识别。在局部淋巴结的副皮质区，抗原肽与一 MHC I/II类分子的复合物分别被CD8+以及CD4+淋巴细胞特异性识别，特异性的CD8+细胞前体在引流淋巴管中克隆增殖，并通过传出淋巴管和胸导管扩散入血流中。在此过程中，其获得了皮肤特异性归巢抗原，并成为效应及记忆T细胞。总之，在机体皮内免疫途径过程中，DC是机体内功能最强和最重要的抗原提呈细胞，是机体免疫反应的始动者，能够显著刺激处女型或初始型T细胞增殖，而巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。疫苗的免疫原性评价是指评价疫苗刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质。对于生物制品——疫苗而言，安全性和免疫原性评价是非常重要的指标。为了降低临床上大量人群使用的风险，一个新上市的疫苗需要进行动物安全性和有效性的可比性研究。可根据不同疫苗的特点，选择安全性、有效性评价指标。安全性方面可考虑进行局部刺激性试验和过敏试验，有效性方面可考虑进行动物免疫原性试验。动物免疫原性在质量标准中称为体内效力试验，是疫苗有效性的重要质量控制指标。传统的IPV的肌肉注射途径效力评价是用Wistar大鼠作为试验动物模型，对于IPV的皮内免疫途径效力，目前还没有报导。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:建立一种猪动物模型，以便有效、准确、稳定地评价脊髓灰质炎灭活疫苗IPV皮内免疫途径的安全性和免疫原性。猪的皮肤具有与人类皮肤极为相似的结构和厚度，并含有丰富的抗原提呈细胞，因此选择其作为一种评价皮内免疫安全性和免疫原性的动物模型。本专利技术所采用的技术方案如下:一种IPV皮内免疫有效性评价用动物模型的建立方法，其选择猪龄为3-5个月、体重为10-20kg的属于华南型猪种的云南版纳小耳猪，经过下列步骤: A、将所选小猪随机分成五组，即无针皮内注射的下列三个试验组:1/3剂量组、1/5剂量组、1/10剂量组，以及肌肉注射的全剂量对照组和生理盐水阴性对照组，每组5~10只，免疫前先对每只小猪采血3-5ml，于37°C下放置2小时，再放入4°C过夜，于次日在无菌条件下吸出血清，冻于-80°C待用； B、对步骤A的1/3剂量组、1/5剂量组、1/10剂量组的每只小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第一次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫，对阴性对照组的每只小猪注射0.5ml生理盐水:免疫后30天采血3-5ml/只，于37°C下放置2小时，再放入4°C过夜，于次日在无菌条件下分别吸取血清，冻于-80°C待用； C、对步骤B的三组小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第二次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫，对阴性对照组的每只小猪注射0.5ml生理盐水:免疫后7天和30天，分别采血3-5ml/只，于37°C下放置2小时，再放入4°C过夜，于次日在无菌条件下分别吸取血清，冻于-80°C待用； D、对步骤C的三组小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第三次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种IPV皮内免疫有效性评价用动物模型的建立方法，其选择猪龄为3‑5个月、体重为10‑20kg的属于华南型猪种的云南版纳小耳猪，其特征在于经过下列步骤：A、将所选小猪随机分成五组，即无针皮内注射的下列三个试验组：1/3剂量组、1/5剂量组、1/10剂量组，以及肌肉注射的全剂量对照组和生理盐水阴性对照组，每组5～10只，免疫前先对每只小猪采血3‑5ml，于37℃下放置2小时，再放入4℃过夜，于次日在无菌条件下吸出血清，冻于‑80℃待用；B、对步骤A的1/3剂量组、1/5剂量组、1/10剂量组的每只小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第一次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫，对阴性对照组的每只小猪注射0.5ml生理盐水：免疫后30天采血3‑5ml/只，于37℃下放置2小时，再放入4℃过夜，于次日在无菌条件下分别吸取血清，冻于‑80℃待用；C、对步骤B的三组小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第二次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫，对阴性对照组的每只小猪注射0.5ml生理盐水：免疫后7天和30天，分别采血3‑5ml/只，于37℃下放置2小时，再放入4℃过夜，于次日在无菌条件下分别吸取血清，冻于‑80℃待用；D、对步骤C的三组小猪，按对应的1/3剂量、1/5剂量、1/10剂量，分别进行第三次无针皮内注射IPV疫苗免疫，同时对全剂量对照组的每只小猪进行肌肉注射0.5ml全剂量的IPV疫苗免疫，对阴性对照组的每只小猪注射0.5ml生理盐水：分别于免疫后1个月、6个月、12个月、18个月和24个月，采血3‑5ml/只，于37℃下放置2小时，再放入4℃过夜，于次日在无菌条件下吸出血清，冻于‑80℃待用；E、将步骤B、C、D分离的各血清于56℃灭活30分钟，用Vero细胞或Hep2细胞在微量96孔培养板上检测中和抗体，其中对照组和试验组样品血清分别用MEM培养液按1: 4，1: 8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024，1:4096，1:8192，1:16384稀释后，按常规用Sabin株I型、Ⅱ型和Pfizer株III型病毒中和各血清，Sabin株I型、Ⅱ型和Pfizer株III型病毒用量为30～300 TCID50，中和条件为35～37℃下中和 3小时，加入细胞，于35～36℃培育7天后，根据CPE判定结果，即建立起IPV皮内免疫有效性评价用动物模型。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖国阳，孙明波，马磊，寸怡娜，蔡玮，周健，杨卉娟，刘婧，张新文，戴忠祥，代小虎，胡文柱，姜述德，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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