一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法技术

本发明专利技术公开了一株高产γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其发酵生产方法。该基因工程菌株名为枯草芽孢杆菌FRD518，保藏编号为CGMCCNO.6772，其染色体上重组整合了透明颤菌的血红蛋白基因（vgb），可成功高表达透明颤菌血红蛋白VHb，显著提高了重组枯草芽孢杆菌低溶氧条件下对氧的利用率；在发酵过程中，通过流加碳源和谷氨酸钠、酵母提取物等成分，工程菌能够高效高产γ-聚谷氨酸，产量达到65g/L以上，比原始野生菌株单批培养时产量提高了147%。该基因工程菌解决了γ－聚谷氨酸生产菌种在高粘、溶氧限制条件下发酵时，产量过低、副产物较多、周期较长及能耗较高等问题，可应用于γ－聚谷氨酸大规模工业化生产中。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一株高产γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其发酵生产方法。该基因工程菌株名为枯草芽孢杆菌FRD518，保藏编号为CGMCCNO.6772，其染色体上重组整合了透明颤菌的血红蛋白基因（vgb），可成功高表达透明颤菌血红蛋白VHb，显著提高了重组枯草芽孢杆菌低溶氧条件下对氧的利用率；在发酵过程中，通过流加碳源和谷氨酸钠、酵母提取物等成分，工程菌能够高效高产γ-聚谷氨酸，产量达到65g/L以上，比原始野生菌株单批培养时产量提高了147%。该基因工程菌解决了γ－聚谷氨酸生产菌种在高粘、溶氧限制条件下发酵时，产量过低、副产物较多、周期较长及能耗较高等问题，可应用于γ－聚谷氨酸大规模工业化生产中。【专利说明】一株产Y-聚谷氨酸基因工程菌及其高产Y-聚谷氨酸方法
本专利技术涉及一株利用基因工程技术改造的高产Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产Y -聚谷氨酸的方法，属于生物工程
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技术介绍
Y -聚谷氨酸(聚- Y-谷氨酸，poly- y -glutamic acid,简称PGA)是一种由微生物合成的氨基酸聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通过Y -聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100~1000KDa之间，相当于500到5000个左右的谷氨酸单体。Y-聚谷氨酸具有优良的成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性和极其强的吸水性，具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶、粘结和强吸水等功能。作为一种生物材料，Y-聚谷氨酸具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害等优点，在食品、化妆品、医药、农业和水处理等领域具有广泛的应用前景。近来国内外主要选用以芽孢杆菌为代表的微生物发酵法来生产Y-聚谷氨酸。早在1937年由Ivanovics首先在anthracis的荚膜中发现了 Y-聚谷氨酸，此后微生物发酵法生产Y-聚谷氨酸有了一些尝试性研究。特别是二十世纪九十年代后，在分离筛选以枯草芽孢杆菌为代表的Y-聚谷氨酸高产菌株方面做了大量的科学实验。Kubota从土壤中分离得到的一株subtil is F921,该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量,该菌株已被Mei ji Seika Kaisha公司成功用于工业化大规模生产Y-聚谷氨酸。Ogawa对Bacillus subtil is MR 2^7进行培养条件优化，在30L的发酵罐中可使Y-聚谷氨酸最大产量达到35 g/L ο Ywm Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，在2.5 L发酵罐中发酵35小时后达到39 g/L的最终产量。国内有研究报道在适量谷氨酸供给条件下，取得产量30 g/L，有望成为生产用株。日本味之素株式会社和台湾味丹企业已经利用发酵方法方法进行PGA的商业化试生产。目前发酵法生产Y-聚谷氨酸过程中，合成代谢途径较为复杂，发酵液中PGA浓度相对较低，并且发酵液及其粘稠，粘度达到数千毫帕秒，发酵液高粘度显著降低了发酵液中的溶氧浓度，形成了低氧环境，非常有限的可利用氧成为限制生产菌种生产和代谢的关键性因素，极大地影响了菌株的代谢生长，降低了 Y-聚谷氨酸合成分泌量，导致Y-聚谷氨酸产率较低。因此寻找一种能够增加发酵液中溶氧浓度的方法或是提高微生物在贫氧环境下的摄氧能力，成为目前Y-聚谷氨酸发酵生产中亟待解决的问题。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由一种专性好氧的革兰氏阴性菌透明颤菌(K/ treosciIla sp.)的血红蛋白基因(Ki treosciIla hemoglobingene, vgb)编码的同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子，在缺氧条件下合成的一种可溶性血红蛋白，是原核生物中迄今为止发现的唯一一种血红蛋白。由于它具有较强的氧传送能力，可以在贫氧环境中促进细菌生长，因此利用透明颤菌血红蛋白基因在发酵菌株中的表达血红蛋白(VHb)，能够有效地解决好氧微生物发酵过程中的供氧问题，在不增加投资的情况下，达到提高产量的目。本专利技术正是基于以上的原理，构建了可表达透明颤菌血红蛋白的Y-聚谷氨酸工程菌株，该工程菌以补料方式发酵培养可高效高产Y-聚谷氨酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株利用基因工程技术改造的高产Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产Y -聚谷氨酸的方法，改造后经独特的流加补料方式发酵培养，生产聚谷氨酸能力较改造前提高了 147%。本专利技术以一株产Y-聚谷氨酸的野生枯草芽孢杆菌作为遗传改造改造对象，经基因工程技术改造后获得的一株高产Y -聚谷氨酸工程菌FRD518，该基因工程菌为同源重组菌，染色体上重组了含有启动子P43、同源重组序列amyE和氯霉素抗性筛选标记的透明颤菌血红蛋白基因vgb等序列的重组载体，重组基因工程菌能成功高表达血红蛋白活性，提高贫氧条件下该菌的摄氧能力和代谢能力，在较低溶氧水平下，大幅度提高Y-聚谷氨酸的产量。本专利技术所提供的可高产Y-聚谷氨酸的工程菌，是将透明颤菌血红蛋白基因(.vgb)以重组载体的方式重组到枯草芽孢杆菌基因组上，所述透明颤菌血红蛋白基因具有GENBANK Aceession Number 为 M30794 的 5’ 端第 142-582 位核苷酸序列。本专利技术所述表达透明颤菌血红蛋白基因的重组载体中所述透明颤菌血红蛋白基因的5’端连接有P43启动子，所述P43启动子具有GENBANK Aceession Number为K02174的5’端第1-476位核苷酸序列，其可在Y-聚谷氨酸生产菌中启动下游基因的表达。本专利技术所述表达透明颤菌血红蛋白基因重组载体中的同源重组序列为淀粉酶(amyE)位点,筛选标记为氯霉素抗性基因。本专利技术将透明颤菌 血红蛋白基因通过基因工程技术构建成枯草芽孢杆菌重组载体 pBluescriptsk (+)-amyE-P43-cat-vgb_amyE,又名为 pSK_P43_vgb (见附图1 说明)。重组载体pSK-P43-vgb通过电转化方法导入Y -聚谷氨酸野生型生产菌株内，经筛选得到高产工程菌株枯草芽孢杆菌UaciJJm 5^ii7i5)FRD5180该基因工程菌株于2012年11月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6772。该基因工程菌经发酵验证，Y _聚谷氨酸产量由改造前24.6g/L提高至45.2g/L，增幅达到81.4%。本专利技术提供了基因工程菌株枯草芽孢杆菌心仰况iJi^FRDSlS发酵高产Y -聚谷氨酸的方法，根据该工程菌株生长代谢特点，在发酵罐上通过连续流加底物方式控制菌的生产和代谢，促进Y-聚谷氨酸高效生产。分别在不同培养时间流加碳源(蔗糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸中任一种或以上混合物)、谷氨酸钠和酵母提取物等底物发酵培养，IOf 100L发酵罐上Y-聚谷氨产量可达到65 g/L以上，比工程菌株枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)mmi^单批发酵培养时产量至少提高35%以上。【专利附图】【附图说明】图1 重组载体 pBluescriptsk ( + ) -amyE-P43-vgb-cat- amyE 结构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产γ‑聚谷氨酸的基因工程菌，该基因工程菌株名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）FRD518，其特征在于：于2012年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6772。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李海军，苏移山，朱希强，张晓元，颜震，王林，凌沛学，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37