本发明专利技术涉及编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途。通过在黑曲霉菌株中表达编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因，显著提高了米黑根毛霉脂肪酶的活性。在缺失糖化酶的黑曲霉中表达所述优化基因时，这种效果更为明显。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。通过在黑曲霉菌株中表达编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因，显著提高了米黑根毛霉脂肪酶的活性。在缺失糖化酶的黑曲霉中表达所述优化基因时，这种效果更为明显。【专利说明】编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉国株及其用途
本专利技术涉及编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶的优化基因。本专利技术还涉及包含上述基因的表达载体。此外，本专利技术涉及包含上述基因或载体的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株及其用途。本专利技术还涉及生产米黑根毛霉脂肪酶的方法,其包括在黑曲霉中表达上述基因或载体。
技术介绍
脂肪酶及RML背景介绍脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一类具有多种催化能力的酶。它催化天然水不溶性底物油脂及其他一些酯类水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时也能催化醇解、酯化和酯交换等反应。因此，该酶广泛应用于油脂加工、食品、医药、生物能源、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化工品和手性化合物有重要意义。不同生物来源的脂肪酶具有不同的蛋白质结构，决定了它们具有不同催化活力和催化专一性。脂肪酶对底物的专一性包括位置(或区域)专一性、脂肪酸专一性及立体专一性等。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)的酶学性质研究较深入且工业应用较广泛° Brady 等(BradyL., BrzozowskiA.M., DerewendaZ.S.A serine proteasetriad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase.Nature.1990,343,767-770)已将该酶的高级结构阐述清楚，表明其具有优良的Sn-1，3立体特异性。Zacharis等(Zacharis E, Omar IC, Partri`dge J, Robb DA, Hailing PJ.Selection of salthydrate pairs for use in water control in enzyme catalysis in organic solvents.Biotechnol Bioeng.1997 Jul 20 ；55(2):367-74.)以米黑根毛霉脂肪酶的转酯化和酯化反应为模型，针对特定的反应底物、反应介质、醇催化剂，选择合适的水合盐调控水活度，提高了非水相催化效率；Pleiss 等(Pleiss J, Fischer M, Schmid RD.Anatomy of lipasebinding sites:the scissile fatty acid binding site.Chem Phys Lipids.1998Jun ；93(1-2):67-80)研究表明在脂肪酸链长专一性上RML对中长链脂肪酸酯较适合。因此，RML可用于制造人造黄油和具有不同熔点且不含各式脂肪酸的甘三酯以及一些“结构脂(Structured lipid)，，。但天然的米黑根毛霉菌株产脂肪酶能力低下，且酶液成分不稳定，存在较大的缺陷，使得其应用成本明显偏高，导致大规模应用受到限制。王斌等(王斌，潘力，郭勇.丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建.华南理工大学学报(自然科学版).2009，37 (6)，84-90)在米曲霉宿主菌A.0ryzae niaD300中成功获得了 RML的表达，但碱滴定法酶活测定表明培养液酶活仅为2.5U/mL。就如何提高米黑根毛霉脂肪酶产量和获得高酶活，国内外报道较少。利用传统方法诱变和优化发酵条件显著提高RML酶活已显得无能为力。黑曲霉系统的异源蛋白表达黑曲霉(Aspergillus niger)具有相对成熟的遗传背景和转化技术、较高的蛋白质分泌能力、高强度启动子、与高等真核生物类似的翻译后加工能力、成熟的发酵工艺和生物安全性等优点，是异源蛋白理想的宿主菌。黑曲霉表达系统的研究已存在很多，但大多数研究的出发点无非都是希望能提高表达系统的效率。Wai Prathumpai 等(Wai Prathumpai, et al.Lipase production byrecombinant strains of Aspergillus niger expressing a Iipase-encoding gene fromThermomyces lanuginosus.Appl Microbiol Biotechnol 2004,65:714-719)在黑曲霉中利用米曲霉中的淀粉酶启动子系统来表达疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶，发现启动子系统的表现与米曲霉中一致，都受葡萄糖抑制，但却能被麦芽糖和淀粉高效诱导，从而能通过改变培养基成分，而轻松提高表达效率。玛丽亚.康奈利等(玛丽亚.康奈利，霍华德.布罗迪.在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法.CN101629204A.2010)对黑曲霉 Bo-1 进行改造，将多个基因(glaA、asa、amyA、amyB、prtT、oah)中一个或多个失活,从而希望达到提高表达效率的效果。随着现代生物工程产业及技术的不断发展，人们对在不同宿主中表达异源重组蛋白的需求和能力都在不断加强。如何提高外源基因在黑曲霉中的表达效率，使之减低工业化生产的成本，同时节能环保，是黑曲霉甚至所有的表达系统最基本的需求和研究热点之O几种高效重组表达策略简介I)密码子优化:根据宿主的密码子偏爱性优化异源基因的密码子能够提高蛋白表达效率，这在一些原核生物和真核生物中均有报道。研究结果认为密码子优化提高了翻译效率从而提高了蛋白表达水平；进一步的研究发现密码子优化能够提高异源基因在真菌中的转录活性即mRNA水平。HugoG Menzella(HugoG Menzella.Comparison of two codon optimizationstrategies to enhance recombinant protein production in Escherichia col1.Menzella Microbial Cell Factories, 2011,10:15)对小牛前凝乳酶(calf prochymosin)基因进行密码子的优化，其采用的随机密码子优化策略获得了的5条优化序列。在大肠杆菌中表达结果发现随机密码子策略的优化序列的表达水平都较原始序列有明显提高，其中一条优化序列更是提高了 70%。Jiangke Yang 等(Jiangke Yang, Liying Liu.Codon optimization through atwo-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillus nigerlip2 gene in Pichia pastoris.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2010,63:164-169)将黑曲霉lip2基因进本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶的优化基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛爱军，蔡海莺，吴伟，冯奇，陶进，曾阿娜，林剑锋，许骏，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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