细胞外核酸的稳定化和分离制造技术

本发明专利技术提供了使用凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂、高渗剂和/或如权利要求书中所定义的式1的化合物使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了使用凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂、高渗剂和/或如权利要求书中所定义的式1的化合物使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置。【专利说明】细胞外核酸的稳定化和分离产生本专利技术的工作接受了来自于欧盟第七框架计划(European Community’sSeventh Framework Programme) (FP7/2007-2013)在拨款协议号 222916 下的资助。
本文公开的技术涉及适合于使含细胞的样品、尤其是血液样品中的细胞外核酸群体稳定的方法和组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离细胞外核酸的方法。
技术介绍
已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应等等来说，是令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源的核酸或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中:W097/035589，W097/34015, Swarup等，FEBS Letters581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sc1.1075:40-49(2006)，Fleischhacker 和 Schmidt, Biochmica et Biophysica Actal775(2007)191-232,Hromadnikova 等，(2006)DNA and Cell biology, Volume25, Numberllpp635_640 ;Fan 等，(2010)Clinical Chemistry56:80`传统上，从含细胞的生物样品例如血液分离细胞外核酸的第一步骤是获得所述样品的基本上无细胞的级分，例如在血液的情况下为血清或血浆。然后从所述无细胞的级分分离细胞外核酸，在处理血液样品时，所述无细胞的级分通常为血浆。然而，获得样品的基本上无细胞的级分可能是有困难的，并且分离常常是繁琐和耗时的多步骤过程，因为重要的是使用仔细控制的条件来防止离心期间细胞破裂，所述细胞破裂可能使细胞外核酸被破裂期间释放的细胞内核酸污染。此外，通常难以去除所有细胞。因此，许多往往且通常被分类为“无细胞”的处理后的样品例如血浆或血清事实上仍含有在分离过程中未被去除的残留量的细胞。另一个重要的考虑因素是:由于离体温育期间的细胞破裂，通常在从抽血事件起相对短的时间段内，细胞内核酸从样品中包含的细胞中释放出来。一旦开始细胞裂解，裂解的细胞就释放出另外的核酸，其与细胞外核酸混合，并且回收用于测试的细胞外核酸变得越来越困难。现有技术中讨论了这些问题(参见例如Chiu等(2001), ClinicalChemistry47:91607-1613 ;Fan 等(2010)和 US2010/0184069)。此外，可用的细胞外核酸的量和可回收性可能在一段时间后由于降解而显著降低。除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，含细胞的样品还可能包含不被包含在细胞中的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。在运输和操作期间保持含细胞的样品、尤其是例如血液样本中的病毒核酸的完整性，对于后续分析和病毒载量监测也是至关重要的。如果样品包含大量细胞，正如在例如使用全血样品的情形中那样，上面讨论的问题尤其成为一个争论点。因此，为了避免或相应地减轻上述问题，通常在获得样品后基本上立即将样品的基本上不含细胞的级分与样品中包含的细胞分离开。例如，推荐的是，在抽取血液后基本上直接从全血获得血浆，和/或将全血和/或得到的血浆或血清冷却，以便保持细胞外核酸的完整性并避免细胞外核酸群体被所包含的细胞释放出的细胞内核酸污染。然而，例如直接从血液分离血浆这一需要是一个主要缺点，因为许多抽取血液的机构(例如医生的诊所)不具有能够有效分离血浆的离心机。此外，如上所述，在常规条件下获得的血浆通常包含残留量的细胞，因此所述细胞在样品操作期间也可能被破坏或可能死亡，从而释放出细胞内核酸、尤其是基因组DNA。这些残留的细胞还造成了下述风险，即，它们在操作期间被破坏，使得它们的核酸内含物、尤其是基因组(核)DNA和细胞质RNA与细胞外循环核酸级分合并，从而污染或相应地稀释所述级分。为了去除这些残留的污染性细胞并避免/减轻上述问题，已知以更高速度进行第二个离心步骤。然而，同样地，这样的大功率离心机在获得血液的机构处通常不可用。另外，即使在抽取血液后直接获得血浆，如果不能直接分离核酸，也推荐将其在_80°C下冷冻以保护其中包含的核酸。这也对样品的处理强加了实际限制，因为例如血浆样品必须被冷冻运输。这提高了成本，并且还造成在冷冻链中断的情况下样品受:损的风险。血液样品目前通常被收集在含有喷雾干燥的EDTA或液体EDTA (例如BDVacutainer K2EDTA)的血液收集管中。EDTA螯合镁、钙和其他二价金属离子，从而抑制酶促反应，例如血液凝固或由DNA酶造成的DNA降解。然而，尽管EDTA是有效的抗凝剂，但EDTA不能有效地防止细胞外核酸群体被释放的细胞内核酸稀释或相应地污染。因此，样品的无细胞部分中存在的细胞外核酸群体在储存期间发生变化。因此，EDTA不能使细胞外核酸群体充分稳定，尤其是因为它不能避免细胞外核酸群体被例如抽血后在样品运输和储存期间由细胞降解和细胞不稳定性产生的基因组DNA片段污染。具体地旨在使全血中包含的循环核酸稳定的方法是现有技术中已知的。一种方法使用甲醛使细胞膜稳定，从而减少细胞裂解，此外甲醛抑制核酸酶。相应的方法被描述在例如US7, 332，277和US7, 442，506中。然而，甲醛或释放甲醛的物质的使用具有缺点，因为它们可能通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而损害细胞外核酸的分离效率。使血液样品稳定的可选方法被描述在例如US2010/0184069和US2010/0209930中。这些最近才开发的方法证实了对提供用于使含细胞的生物样品稳定以允许有效回收例如这样的样品中包含的细胞外核酸的手段的极大需求。然而，尽管存在这些最近才有的发展，但对开发下面这样的样品处理技术仍存在持续不断的需求:所述样品处 理技术能够使生物样品、尤其是含有细胞的样品、包括怀疑含有细胞的样品、特别是全血、血浆或血清中包含的细胞外核酸群体稳定，从而使这样的样品的操作或相应的处理更加容易(例如通过避免从全血直接分离血浆的需要或避免冷却或甚至冷冻分离的血浆的需要)，从而也使这样的样品中包含的细胞外核酸的分离和测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于收集含细胞的样品的容器，所述容器包含适用于使所述含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定的稳定化组合物，所述含细胞的样品优选为血液、血浆或血清样品，其中所述稳定化组合物包含半胱天冬酶抑制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·霍利茨，阿娜贝勒·舒伯特，马库斯·施普伦格豪塞尔斯，
申请(专利权)人：普瑞阿那利提克斯有限公司，
类型：
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