植物转化方法技术

本发明专利技术提供产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤：a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化由所述外植体包含的细胞，和c)通过将所述外植体的下胚轴插入到所述生长培养基中来将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基中。此外，本发明专利技术提供通过本发明专利技术的方法获得的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤：a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化由所述外植体包含的细胞，和c)通过将所述外植体的下胚轴插入到所述生长培养基中来将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基中。此外，本专利技术提供通过本专利技术的方法获得的植物。【专利说明】 本专利技术涉及产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤:a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化所述外植体包含的细胞，和c)将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基上。此外，本专利技术涉及通过本专利技术的方法可获得的植物。在1984年首次为烟草描述的农杆菌介导的植物转化目前广泛用于将基因导入植物中，用于基础研究以及产生商业使用的转基因作物的目的。能够成功转化的植物包括大部分主要的经济作物、蔬菜、观赏植物、药用植物、水果、树木和牧草植物。植物转化主要通过农杆菌介导的植物转化来完成。农杆菌是天然存在的病原土壤细菌，其能够转移DNA进入植物细胞的基因组中。对于农杆菌介导的植物转化，将目的基因置于农杆菌T-DNA(转移DNA)的左边界和右边界重复序列之间。随后，使用合适的植物转化方案(对于综述参见 Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1):16-37)将含有目的基因的T-DNA区稳定整合到植物基因组中。除了农杆菌介导的植物转化之外，还存在其他，如病毒转化、植物原生质体的电穿孔和粒子轰击。—般而言，植物转化技术基于相同的原理。在第一步中，将目的基因导入合适的转化载体中。随后将携带有目的基因的转化载体导入目标植物的再生细胞中。由于仅有一小部分的目标细胞接受了目的基因，因此在大`量过量的未转化细胞中进行转化的植物细胞的选择。此外，一旦已经将目的基因稳定导入宿主细胞的基因组中，那么确定再生条件以从单个转化的植物细胞再生完整植株至关重要(参见例如Birch，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mo1.Biol.48:297-326)。最简单可用的基于农杆菌的之一是“浸花转化”。浸花是种系转化方法，通过所述方法可以将目的基因转化到产生种子的细胞中。该方法涉及在农杆菌细胞的悬浮液中浸泡植物(开花早期阶段)(Clough和Bent, 1998，Plant J16:735-43)。浸泡后几周，收集浸泡植物的种子，并选择转化体的种子群体。浸花转化技术的优势是它避免使用成本密集并需要受过训练的工作人员的组织培养和植物再生。不幸的是，小的植物尺寸、短的世代时间以及每株植物大量的种子是用于浸花的必要条件。因此，该转化方法仅仅成功地应用于少数物种，主要用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(但还有蔡藜苜猜(Medicagotruncatula)和芸苔(Brassica),参见 Wang 等 2003.Plant Cell Reports22:274-281)。认为难以进行种系转化的完整转化植物的再生是植物转化中的瓶颈，这是由于再生难以实现，耗时并且需要特殊设备。植物再生的第一步通常在体外条件下进行，即在无菌条件下的特殊营养培养基上。转化目标细胞后，通过特定的植物激素诱导细胞分裂，以从转化的植物细胞中生长出愈伤组织。愈伤组织诱导后，将所获的愈伤组织转移到允许枝条诱导的培养基上。将愈伤组织在所述培养基上培养(在体外条件下)直至形成枝条。枝条形成后，将枝条转移到允许根形成的培养基上(在体外条件下)。根形成后，一般将再生的小植株(即具有根的枝条)从体外条件转移到离体(ex vitro)条件下，主要转移到温室条件下的土壤中。因此，愈伤组织诱导、枝条诱导和根诱导一般均在体外条件下进行。然而，体外条件下再生植物的当前方法具有一些缺点。在体外条件下再生完整植物花费高，并且需要特殊的营养培养基、特殊的设备和受过训练的工作人员。当然，常常存在污染的风险(例如，真菌污染)。如果组织培养受到污染，数周或甚至数月的工作可能都会前功尽弃。然而，不采用组织培养，植物转化是有挑战的，这是由于组织培养a)允许分别选择转基因植物细胞(和植物枝条)并且b)同时抑制了细菌和真菌微生物的生长。不进行选择的话，难以鉴定携带转基因的植物细胞、植物枝条或小植株(即具有枝条和根的植物)。此外，转基因植物的再生一般是耗力并且非常耗时的工作。例如，从假定的转基因体外芸苔或短柄草(Brachypodium)枝条到离体适应的、适合温室的植物的分离所需时间为12周至14周(对于短柄草例如参见:Bablak等(1995)Plant Cell, Tissue and OrganCulture42:97-107 ;或 Christiansen 等(2005)Plant Cell Report23:751-758 ;对于芸苔:Cardoza 和 Stewart (2004), Transgenic cropsOf the World-Essential Protocols,379-387 ;或 Jonoubi 等(2005).Biologia Plantarum49 (2):175-180)。避免组织培养或减少组织培养的转化程序将是有价值的，尤其对难以再生的植物而言。科研人员已经尝试开发不需要组织培养的植物转化程序，但这些尝试仅获得了有限的成功。例如，Graves和Goldman(1986PlantMol.Biol.7:43-50)报道了农杆菌可以感染萌发的玉米种子的中胚轴细胞，但所获的转化植物为嵌合体并且转化效率极低。大?(大? (Glycine max))属于?科(Fabaceae) ( ?科(Leguminosae))。将该植物科被鉴定为它的种子长在 豆荚中(荚果)。认为大豆起源于中国。野生型大豆在自然界中是葡萄树样的(viny)，这可能是为何大豆首先作为干草作物被引进美国的主要原因。从中国、中国东北(Manchuria)、韩国和日本引进对于美国开发变种是重要的。改善农艺性状的现代育种努力，如更直立的生长、降低倒伏和提高的种子大小已经在将大豆开发成为世界重要的作物中起了主要作用。收获谷物的作物的栽培面积和比例稳步增长，并且如今大豆成为主要的世界性商品。关于大豆转化，基于体细胞胚胎发生的方法是已知的:通过将外植体置于高水平的2，4-D(40mg / L)上从未成熟的大豆子叶上诱导胚，并且胚胎发生组织随后在诱导培养基上(Finer (1988)Plant Cell R印7:238-241)或液体悬浮培养(Finer和Nagasawa(1988)Plant Cell Tissue Organ Cultl5: 125-136)中增殖。Hinchee等描述了经农杆菌介导的转化产生转基因大豆植物。转基因植物的产生基于其中在大豆子叶上诱导枝条器官发生的再生方案(参见Hinchee等(1988)NatureBiotechnology, 6:915-922)。还已知的是基于合子未成熟子叶的农杆菌介导的转化方法(Parrott等(1989)Plant Cell R印7:615-617 ;Yan 等(2000)P本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤：a)提供损伤的可转化外植体，其包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和选自以下的损伤组织：i.初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织，ii.子叶节的损伤的分生组织，和iii.损伤的上胚轴组织，b)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞，c)通过将所述外植体的下胚轴或其部分插入到生长培养基中来将所述外植体转移到所述生长培养基中，所述生长培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，其中将所述外植体以向上的位置置于所述生长培养基中，d)允许所述外植体形成枝条和／或允许该枝条伸长，所述枝条包含植物细胞，所述植物细胞包含含有所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒的所述多核苷酸，和e)从所述枝条再生转基因植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：YF·常，A·S·万古丽，L·格里斯特，H·图特勒，H·P·洪，P·奥尔霍夫特，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：
国别省市：