本发明专利技术涉及一株降解AFB1的泰山枯草芽孢杆菌；于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC?No?8186,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。经实验证明，将其发酵液与发霉饲料于37℃下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB1，且效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，而且具有操作简单、成本低等优点，适合在饲料方面规模应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一株降解AFB1的泰山枯草芽孢杆菌；于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC?No?8186,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。经实验证明，将其发酵液与发霉饲料于37℃下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB1，且效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，而且具有操作简单、成本低等优点，适合在饲料方面规模应用。【专利说明】—株降解AFB1的枯草芽孢杆菌(-)专利
本专利技术涉及从一株降解AFBl的枯草芽孢杆菌。(二)专利技术背景黄曲霉毒素(Aflatoxius, AF)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillums nomius)、特异曲霉(A.nomius)、假溜曲霉(A.pseudotamarii)等几种真菌产生的次生代谢产物，对人类和畜禽的健康危害很大。1960年6月，在英国伦敦郊区的10万只火鸡突然发病死亡，追究原因是从巴西进口的花生柏被一种来自真菌的有毒物质污染。剖检后发现肝脏出血，肾脏肿胀，因病因不明，被定为火鸡χ病。后经过研究发现，火鸡的死亡原因由饲料中分离出的黄曲霉所产生的荧光物质造成的，将此物质命名为黄曲霉毒素，该结果引起了全世界的关注。后来经过许多学者的研究证明，黄曲霉毒素不但可以引起中毒，长期食用被其污染的食品还可引发癌症，具有很强的毒性、致癌性、致突变性和致畸性，它可通过食物和饲料直接危害人类和动物的健康.黄曲霉素B1 (AFBl)广泛存在于饲料原料中如玉米、高粱、花生粉、豆柏、棉籽柏等。到目前为止，黄曲霉毒素仍是对畜牧业威胁最大的霉菌毒素之一。各种动物对黄曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999年)报道，日粮中含0.2mg / kg黄曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低，降低程度与黄曲霉毒素浓度有关。Prasad (2002年)研究了AFBl对家禽的影响发现，单一剂量AFBl的平均半数致死量(LD50) (mg / kg体重)鸡6.5~16.5、鸭0.34，鸭比鸡更敏感，尤其是雏鸭。对于生长禽日粮中的AFBl的安全值，一般认为不应超过20ug / kg。研究还发现，通过食物链进入人体的黄曲霉毒素具有极强的致癌作用，严重威胁人类健康，因此，解决谷物粮食和动物饲料的黄曲霉毒素污染是一个世界性难题。传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、氧化法、吸附剂法，这些方法存在 效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产等缺点；因此，黄曲霉毒素污染的控制急切需要一种高效率、特异性强以及对饲料和环境没有污染的技术。黄曲霉毒素生物降解，是指黄曲霉毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分的胞内、胞外酶分解破坏，同时产生无毒的降解产物的过程。毒素生物降解是一种化学反应的过程，不是对毒素的物理性吸附作用。利用微生物或其代谢产物进行解毒具备以上优势，代表了生物解毒的新方向，且生物酶催化方法具有专一性强、转化效率高的特点备受研究者的关注。(三)
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术从泰山土壤中分离得到一株降解AFBl的泰山枯草芽孢杆菌；经实验证明，泰山枯草芽孢杆菌发酵液及其产生的活性物质降解AFBl的效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，适合在食品及饲料方面规模应用。一株泰山枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101 ;保藏号CGMCC No8186,其16srDNA如SEQ.N0.1所/Jn ο所述泰山枯草芽孢杆菌形态如下:菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性，MR-VP试验阳性，淀粉水解阳性。挑取泰山枯草芽孢杆菌于50ml BPY液体培养基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸馏水lL，pH=7.0)培养8h后，以6%接种量将此菌液接种于100mlBPY液体培养基中，在37°C、180r/min条件下摇瓶培养24h制得枯草芽孢杆菌发酵液，将其与发霉饲料于37°C下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB I。本专利技术的有益效果主要体现在:本研究从泰山土壤中分离了一株枯草芽孢杆菌，将其发酵液与发霉饲料于37°C下共同作用72h，发酵液产生的活性物质能降解发霉饲料中的AFB1，且效率高，作用效果温和，安全性高，不影响原有品质，而且具有操作简单、成本低等优点，适合在饲料方面规模应用。(五)专利技术附图图1泰山枯草芽孢杆菌发酵液不同组分对AFBl的降解率。由图可知，泰山枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素降解的活性物质是一种胞外分泌物，主要存在于其发酵后的上清液中。图2泰山枯草芽孢杆菌发酵后`的上清液热处理和蛋白酶K处理后对AFBl的降解率。由图可知，泰山枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素的降解活性物质是发酵上清液中的一种酶.图3经泰山枯草芽孢杆菌发酵液处理前后霉变饲料中AFBl含量图。由图可知，经泰山枯草芽孢杆菌发酵液处理后霉变饲料中AFBl含量由63.5ug/kg降为8.2ug/kg，降解率达到87.1%。说明泰山枯草芽孢杆菌发酵液在实际生产中能高效率的降解霉变饲料中的AFBI。(六)【具体实施方式】实施例1.泰山枯草芽孢杆菌的分离采集含淀粉丰富的泰山土壤，80°C的水浴处理I小时，利用稀释涂布法在含淀粉的平板培养基(牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉5.0g、琼脂20g和蒸馏水1000ml pH=7.2)上培养1_3天后观察。然后进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色鉴定，确定是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活性，最后确定菌株。实验流程:倒平板_制备梯度稀释液_涂布_培养_初筛_复筛_纯化_保存( I)制备土壤稀释液取泰山天外村花坛附近土样,去除表层5cm,取5_15cm处。用无菌器具采样100g,装入无菌塑料袋中扎好，记录采样时间地点。将土样与无菌水充分混合，振摇20min,80°C水浴I小时后取出。无菌吸取Iml 土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀,制成?ο-1稀释度的土壤溶液；以此类推，利用上述方法再分别制成10_2、10_3、10_4、10_5不同稀释度的土壤溶液。(2)涂布无菌吸取10_3、10_4、10_5三个梯度土壤液各0.2ml滴在所述的含淀粉的平板培养基中央。用无菌涂布器涂布。(3)培养将淀粉培养基平板倒置于30度培养箱中培养1-3天。(4)初筛观察菌落形态，与标准菌株比对，去除非目的菌株；进行革兰氏染色，显微镜下观察；进行淀粉酶、MR-VP生化试验，最终得到9株菌株。(5)复筛分别挑取初筛出的9株菌株(分别编号为:泰山001、泰山002、泰山003、泰山004、泰山005、泰山006、泰山007、泰山008和泰山009)的单菌落于50ml BPY液体培养基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸馏水lL，pH=7.0)培养8h后，将此菌液以6%接种量接种于100mlBPY液体培养基中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株保藏号为CGMCC?No.8186的泰山枯草芽孢杆菌，已于2013年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16srDNA如SEQ.NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴同杰，孙玲玉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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