用于检测JC病毒DNA的测定制造技术

一方面，本公开提供用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法。一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒DNA的量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】一方面，本公开提供用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法。一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒DNA的量的方法。【专利说明】用于检测JC病毒DNA的测定相关申请本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2011年7月29日提交的美国临时申请号61 / 513,483的权益，所述临时申请的内容特此以引用的方式整体并入。专利
本专利技术属于生物样品中的核酸的检测领域。专利技术背景JC病毒(JCV)是已知引起被称为进行性多灶性白质脑病(PML)的中枢神经系统(CNS)的罕见病症的人多瘤病毒。脑脊髓液(CSF)中的JCV的检测是PML的确证，但其在技术上是有挑战性的。因此需要用于CSF中的JCV的检测和定量的改进的测定。专利技术概述本专利技术的不同方面(尤其)提供用于从脑脊髓液样品分离核酸(例如像JC病毒(JCV)DNA)的方法和试剂盒。根据本专利技术的方面，被认为不含病毒的生物样品(例如，使用标准技术鉴定为不含JCV的CSF样品)实际上确实含有可使用本文所描述的技术检测到的病毒(例如，JCV)。检测脑脊髓液样品中JCV的存在可能是具有挑战性的，这是因为在一些情况下病毒以小量存在，这可能导致假阴性判定。在一些方面，本文所描述的是新颖的核酸检测方法和试剂盒，所述方法和试剂盒通过增加可以从脑脊髓液样品分离的核酸的产率来部分地减少假阴性结果。这在一些情况下可以通过提供比当前技术中使用的更多的起始材料(例如，较大体积的脑脊髓液)和/或更少载体(例如，较低浓度的RNA)来实现，但本专利技术不限于此。因此，在一些方面，本专利技术提供从脑脊髓液样品分离核酸的方法，所述方法包括将载体核酸和/或蛋白酶添加至CSF样品，孵育包含所述载体核酸和/或所述蛋白酶的样品，将孵育的样品施加至核酸结合柱，洗涤施加有所述样品的柱，以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致核酸的分离。在一些实施方案中，CSF样品的体积为至少1ml。在一些实施方案中，载体核酸为载体RNA。在一些实施方案中，脑脊髓液样品中载体RNA的浓度为约2.8yg /ml或更小(或为2.8μ g / ml或更小)。应了解，本专利技术涵盖包括任何一个或多个上述步骤(例如，任何单个步骤或任何两个、三个、四个或五个上述步骤的组合)(或由其组成，或基本上由其组成)的方法。在一些实施方案中，所述方法还可包括另外步骤。本专利技术还涵盖进行一个或多个步骤一次以上，例如，可能有利的是进行洗涤步骤两次或更多次。作为另一个实例，还可能有利的是进行洗脱步骤一次以上。在这类情况下，可通过任何标准方法(例如，乙醇沉淀)来进一步浓缩洗脱的核酸。本专利技术还涵盖省略或取代一个或多个上述步骤。例如，在一些情况下，可使用其它固相提取材料(例如，二氧化硅或其它)代替结合柱来捕获和/或纯化核酸。一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒(JCV)的量的方法、试剂盒以及核酸。JCV是已知引起被称为进行性多灶性白质脑病(PML)的中枢神经系统的罕见病症的人多瘤病毒。JCV与BK病毒享有大约75% 的核苷酸同源性，所述BK病毒为多瘤病毒家族的另一成员，其通常感染人类，但不会引起PML。尽管最初被鉴定为HIV感染的主要并发症，但是近年来免疫抑制治疗性抗体已经与增加的PML发病率相关。在一些实施方案中，中枢神经系统中的JCV的检测是确证受试者中PML的存在的重要步骤。CSF中的JCV的早期检测可以用作开始PML早期治疗(例如，在严重疾病症状的进展之前)的依据。因此，JCV的早期检测对于良好的患者预后可能是重要的。在一些实施方案中，本专利技术的方面涉及测定技术和试剂，所述测定技术和试剂可增加生物样品(例如，CSF样品)中JCV检测的灵敏度。在一些实施方案中，本文所描述的实时PCR测定特异性地检测人CSF中的JCV，灵敏度为10拷贝/ mL。本专利技术的方面涉及用于确证具有PML的病征或症状(例如，早期病征或症状)的受试者中PML的诊断的方法和组合物。在一些实施方案中，患者的CSF中JCV的存在是PML的诊断(例如，如果患者具有PML的一种或多种其它病征或症状)。在一些实施方案中，受试者的CSF中JCV的存在可适用于确定受试者处于PML的风险。具体地说，本专利技术提供用于在受试者的免疫系统受损或受抑制的情况下确定受试者是否处于发展PML的风险的方法和组合物。例如，本专利技术的方面涉及通过测定由于存在JCV感染而造成的受试者的发展PML的风险阈值来确定受试者是否适于用免疫抑制剂(例如，那他珠单抗或其它免疫抑制剂)开始或继续治疗。应认识到，当患者的CSF中JCV的存在用于诊断PML(例如，PML的早期诊断)时，则可针对PML对患者进行治疗和/或患者正在接受的免疫抑制治疗可在适当时中断。`因此，在一些实施方案中，本专利技术的方面涉及一种方法，所述方法用于通过以下方式来从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸:将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品、孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品、将孵育的样品施加至核酸结合柱、洗涤施加有所述样品的柱以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致核酸的分离。在一些实施方案中，CSF样品的体积为至少lml。在一些实施方案中,载体核酸为载体RNA。在一些实施方案中，CSF样品中载体RNA的所得浓度为2.8微克/ ml或更小。在一些实施方案中，孵育样品包括在室温`(RT)下孵育样品的第一步骤和在高于RT的温度下孵育样品的第二步骤。在一些实施方案中，孵育步骤为15分钟长。在一些实施方案中，高于RT的温度为56°C。在一些实施方案中，洗涤柱包括将洗涤缓冲液添加至柱并且以4000g的离心力使柱旋转。在一些实施方案中，施加洗脱剂包括将洗脱剂施加至柱至少两次。在一些实施方案中，将洗脱剂在柱上孵育5分钟。在一些实施方案中，施加30微升洗脱剂。在一些实施方案中，CSF样品中的核酸为DNA，例如病毒DNA (例如，JCV DNA或其它病毒DNA)。在一些实施方案中，通过进行实时聚合酶链式反应(实时PCR)来测定JC病毒DNA的量来针对核酸(例如，DNA，例如病毒DNA)进行测定。然而，可使用其它检测方法(例如，其它PCR方法、其它扩增方法、其它基于杂交的方法、一种或多种测序方法等)。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针针对JC病毒T抗原编码序列。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，本专利技术的方面涉及一种用于通过在样品上进行实时PCR来测定样品中的JC病毒DNA的量的方法，其中实时PCR引物和探针针对JC病毒T抗原编码序列。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，本专利技术的方面涉及一种用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括蛋白酶、载体核酸、核酸结合柱和/或使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括针对JC病毒T抗原编码序列的实时PCR引物和探针。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO:1-2和SEQ IDNO:3。在一些实施方案中，本专利技术的方面涉及一种核酸引物，所述核酸引物特异性地杂交至(例如，在严格杂交条件下)保守病毒序列(例如，保守本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法，所述方法包括：将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品，孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品，将孵育的样品施加至核酸结合柱，洗涤施加有所述样品的所述柱，以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致所述核酸的分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：索马·雷，
申请(专利权)人：生物基因IDECMA公司，
类型：发明
国别省市：美国;US