本发明专利技术建立了一种融合表达小分子蛋白(多肽)的新方法，其特征是：以水蛭素为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达，同时在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间设计一个连接肽(其中包含蛋白酶或化学切割位点或可自切割的蛋白内含子intein)，这样融合蛋白表达后可通过酶切或化学切割或诱导自切割释放出目的蛋白(多肽)。该法优点：(1)水蛭素融合伴侣(标签)较小(分子量7Kd)，可有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占比率，最终提高目的小分子蛋白(多肽)产量；(2)水蛭素作为融合伴侣(标签)融合后仍具抗凝活性，可方便对融合蛋白的表达和纯化进行实时检测与追踪。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术建立了一种融合表达小分子蛋白(多肽)的新方法，其特征是：以水蛭素为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达，同时在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间设计一个连接肽(其中包含蛋白酶或化学切割位点或可自切割的蛋白内含子intein)，这样融合蛋白表达后可通过酶切或化学切割或诱导自切割释放出目的蛋白(多肽)。该法优点：(1)水蛭素融合伴侣(标签)较小(分子量7Kd)，可有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占比率，最终提高目的小分子蛋白(多肽)产量；(2)水蛭素作为融合伴侣(标签)融合后仍具抗凝活性，可方便对融合蛋白的表达和纯化进行实时检测与追踪。【专利说明】
本专利技术属于基因工程领域，涉及建立一种重组多肽融合表达新技术，该技术的技术特征是以水蛭素为融合伴侣(标签)制备重组小分子蛋白(多肽)。技术背景当采用基因工程技术表达一些外源性多肽或小分子蛋白时，表达产物往往会由于被宿主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题，目前普遍采用融合表达技术。所谓融合表达就是通过基因重组技术将外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侣(标签)下游进行表达，然后通过酶切或化学切割释放出目的小分子蛋白(多肽)的技术。在进行基因拼接融合时应保持目的小分子蛋白(多肽)编码基因与融合伴侣(标签)编码基因阅读框架一致。此外，在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间需要设计I个或I个以上的蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子(intein)，这样就可以在融合蛋白表达出来之后通过酶切或化学切割或诱导自切割等手段释放出目的小分子蛋白(多肽)。采用融合伴侣(标签)进行融合表达的优点在于:⑴对分子量较小的外源目的小分子蛋白(多肽)进行融合表达可增强表达产物的稳定性，减少或避免宿主细胞蛋白酶对表达产物的降解；(2)某些融合伴侣(标签)可以增强目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分离纯化。目前普遍 使用在低等生物或细菌中以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣(标签)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表达量、可溶性及稳定性，采用的融合伴侣(标签)有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST，28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物异构酶(NusA, 55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶(Dsb A,21kDa)等。然而，在使用上述这些融合伴侣(标签)对小分子目的蛋白(多肽)进行取融合表达时，虽然融合蛋白容易得到高水平表达，但由于融合伴侣(标签)自身分子量偏大，小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率相对较低(通常仅占到融合蛋白的1/5~1/10甚至更低)，这样就势必严重影响了小分子目的蛋白(多肽)的最终收率。水蛭素是一类从医用水蛭唾液腺中分离得到的抗凝抗栓多肽物质，分子量为7Kd，由65-66个氨基酸残基组成，是目前发现的最强的凝血酶特异性抑制剂。水蛭素分子形如蝌蚪，分为头、体、尾三部分:(I)头部N端形成一个致密、疏水的球状结构(1-47)，含有3个链内二硫键(Cys6_Cysl4，Cysl6_Cys28，Cys22_Cys39)，它可与凝血酶活性位点结合，抑制其催化活力；(2)尾部C端(49-65)含有多个带负电的酸性氨基酸，它与凝血酶的阴离子结合表位(纤维蛋白原结合位点)结合，抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用；(3)中间部分pro-Arg-pro (46-48)与凝血酶的精氨酸环(侧链凹穴)结合，不被蛋白酶降解，具有很好的稳定性。水蛭素抑制凝血酶的作用过程由两个步骤完成。首先，水蛭素C端尾部结合到凝血酶的阴离子结合位点区域上，然后水蛭素N端核心区域结合到凝血酶活性位点，头尾两个功能区协同作用，对凝血酶具有高度的亲和性。水蛭素分子非常稳定，即使在100°c加热5-10分钟都不会改变其结构和生物学活性。目前水蛭素分子已经在大肠杆菌中已获得高水平分泌表达(J Ind MicrobiolBiotechnol, 2012, 39 (10):1487-1494.)。本专利技术根据水蛭素的分子结构特征，以其为融合伴侣(标签)建立了一种新的融合表达系统，该系统的显著技术特征是:以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)融合表达目的小分子蛋白(多肽)，然后以酶切或化学切割等方式从融合蛋白中释放出小分子目的蛋白(或多肽)。该系统的显著优点是:(I)水蛭素融合伴侣(标签)分子量较小，可以有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中的比率；(2)通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性可以方便快捷地对重组融合蛋白的表达水平进行实时检测；(3)利用水蛭素融合伴侣(标签)的理化性质快速纯化融合蛋白并在纯化过程中对之进行追踪。
技术实现思路
本专利技术目的在于建立一种融合表达小分子蛋白(多肽)的新方法。该方法的显著技术特征是:以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。此外，为了在融合表达后能够得到目的蛋白(多肽)，可以在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间设计一个连接肽(其中可以包含蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子intein)，这样可以在表达后对融合蛋白进行酶切或化学切割或诱导自切割以释放出目的蛋白(多肽)。该融合表达方法的显著优点是:(I)水蛭素融合伴侣(标签)分子量较小(分子量7Kd)，这样可以有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率，从而最终提高目的小分子蛋白(多肽)的产量；(2)水蛭素作为融合伴侣(标签)融合后仍具有抗凝活性，这样可以通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性方便快捷地对融合蛋白的表达水平进行实时检测；(3)在融合蛋白纯化过程中可以通过分析其抗凝活性而对其进行追踪。露那辛(Lunasin)是一种最`初从大豆中分离得到的活性肽，由43个氨基酸残基组成，分子量为5KDa，具有体外及动物体内实验及动物学实验表明:具抗有抗炎、肿瘤预防等药理活性。由于露那辛多肽在植物体内含量非常低，且合成成本较高。为此，本专利技术以以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)，将露那辛拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。同时在两者之间设计一个含牛肠激酶酶切位点的连接肽，这样融合蛋白表达后可以通过牛肠激酶进行切割从而释放出N-末端与天然露那辛完全一致且具有生物活性的目的多肽露那辛。本专利技术所建立的以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)的表达方法不只限于露那辛的表达，该方法可以应用于其它蛋白或多肽的融合表达。【专利附图】【附图说明】图1:融合蛋白rHV3-Lunasin编码基因序列。灰色部分为水蛭素III (HV3)融合标签，其后为-GGGDDDDK-连接肽，箭头所指为牛肠激酶切割位点，切割位点之后为目的多肽露那辛序列，*代表终止密码子。图2:融合蛋白(rHV3_Lunasin)分泌表达载体pTASHL示意图。Ptac:Tac启动子；AP:氨苄抗性基因，HV3:水蛭素III基因，Luansin:露那辛(Luansin)基因，Sig:L-门冬酰胺酶II信号肽简并基因，Ori:pUC质粒复制起始点，rrnBTlT2:转录终止子。图3:牛肠激酶酶切rHV3-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合表达小分子蛋白(多肽)的方法，其技术特征是：以水蛭素为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，张萍，代广知，徐振雷，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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