本发明专利技术公开了一种检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的方法、引物和试剂盒，包括：扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-1区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-2区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。利用该方法和试剂盒可以简便、高效、特异地检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的方法、引物和试剂盒，包括：扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-1区域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3；扩增凝血因子Ⅷ基因Intlh-2区域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4。利用该方法和试剂盒可以简便、高效、特异地检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位。【专利说明】检测甲型血友病凝血因子WI基因第一内含子倒位的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子的引物、方法和试剂盒，利用长片段PCR扩增技术可以对甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位进行检测。
技术介绍
血友病是一组遗传性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A(甲型)、血友病B (乙型)和遗传性因子XI缺乏症(丙型)。前两者为性连锁隐性遗传，后者为常染色体不完全隐性遗传。甲型血友病是一种由于凝血因子VDI (Factor VIII，F VDI)基因缺陷导致患者产生严重凝血障碍的X染色体连锁隐性遗传病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。?珊基因位于乂928，长度约186kb，含有26个外显子和25个内含子。F VDI基因不仅结构庞大，而且导致血友病A的基因突变种类繁多，其中最常见的是由FVDI基因第22号内含子倒位突变引起的F VDI严重缺乏，它是45%~50%重型血友病A患者的分子发病机制，而F VDI基因第I号内含子 倒位是另一常见突变，约5%的重型血友病A是由该突变所致。F VDI基因第I号内含子倒位与F VDI抑制物形成的关系:自1996年Brinke等首次发现了 FVDI基因第I号内含子可发生倒位以来，近年来越来越多的研究报道，FVDI第I号内含子倒位是仅次于第22号内含子倒位导致重型血友病A的常见原因。目前认为，第I号内含子倒位发生率为1.2^5%之间。最近，Schroder等对德国的1127例血友病A患者的研究结果显示，有23例患者发生第I号内含子倒位，占2.04% ( 23/ 1127 )，抑制物阳性率为26.09%,明显高于其他国家。FVDI基因在其第I号内含子倒位产生的分子机制与第22号内含子倒位的分子机制非常相似，其本质都是由于基因组水平上F VDI基因内部和外部靠近远端的高度同源序列发生基因重组，从而影响F VDI基因mRNA的形成，造成正常蛋白严重缺乏而导致重型血友病A的发生。FVDI基因在其第I号内含子内有一段1041bp的序列(丨社111-1)，和与？珊基因相隔约140kb处的另一段序列(intlh-2)的同源性高达99.9%。Intlh-2区域位于C6.1A基因和VBPI基因之间，其方向与intlh-Ι完全相反(如图1所示)。Inilh-1和inilh_2发生基因重组后形成两个嵌合的mRNA:—个mRNA包含F VDI基因的第I号外显子及后续的VBPI基因第2号外显子到第6号外显子，受F VDI基因的启动子调控；另一个mRNA包含C6.1A基因几乎所有编码区及后续的F珊基因部分第I号内含子和第2号外显子到第26号外显子，受C6.1A基因的启动子调控。由于F VDI基因大部分编码区位于C6.1A基因终止密码子的下游并与F珊基因信号肽分离，因而即使这种嵌合的mRNA能够稳定存在并在肝脏中足量合成，也不可能有F VDI蛋白分泌至外周血中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用一种检测甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子倒位的引物序列，利用该引物序列可以简便、高效、特异的检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位。本专利技术提供检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括: (i )扩增 FVDI 基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3，其碱基序列为:SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGCSEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； (ii )扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4，其碱基序列为:SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAASEQ ID N0.4:TG GGTGATATAAGCTGAGCTA。进一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 使用浓度分别为 2 μ M、2 μ M 和 2 μ Mo进一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 使用浓度分别为 2 μ Μ、2 μ M 和 2 μ Mo本专利技术还提供检测甲型血友病凝血因子VDI基因的第一内含子倒位的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (i ) PCR扩增反应试剂； (?)权利要求1所述引物序列。进一步地，所述PCR扩增反应试剂包括dNTP、2*PCR缓冲液、Mg2+、Taq酶。进一步地，Mg2+反应终浓度为1.0mM ；dNTP反应终浓度为3.0mM。本专利技术还提供了一种检测甲型血友病凝血因子珊基因的第一内含子倒位的方法，包括如下步骤: (i )采集待测血液样本，提取DNA ； (? )以该DNA为模板，进行LD-PCR扩增，得到PCR反应产物，其中所述PCR引物为扩增 F VDI基因 Intlh-1 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 ;其碱基序列为:SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGCSEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； 扩增 F VDI基因 Intlh-2 区域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 ;其碱基序列为:SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAASEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA ； (iii)步骤(ii )中获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析检测结果。进一步地，步骤(ii )的PCR反应按以下条件进行扩增:94°C 2min预变性；94°C30s、64°C 30s,72°C 3min，30 个循环；72°C IOmin0进一步地，扩增分为两管完成，第一管包含3条引物，分别为SEQ ID N0.USEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3 ;第二管包含3 条引物，分别为 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4。进一步地，第一管中的引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3使用浓度分别为 2μΜ、2μΜ和 2μΜ;本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括：(ⅰ) 扩增FⅧ基因Intlh‑1区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，其碱基序列为：SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID NO.2：GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGCSEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA；(ⅱ) 扩增FⅧ基因Intlh‑2区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，其碱基序列为：SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGASEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAASEQ ID NO.4：TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋坤，周晓犊，王淑一，孙翠莲，
申请(专利权)人：长沙艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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