本发明专利技术涉及一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段；和S10编码区的205bp；和S4编码区的203bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。本发明专利技术通过特殊设计并优化，针对RBSDV S8、S10、S4三个基因共614bp的RNAi靶序列，获得特定的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，克隆并构建到RNAi载体pBDL03中，获得RNA沉默载体pBDL03-S8+S10+S4，然后通过农杆菌转化法转到水稻品种泰粳394中。T1代阳性植株对RBSDV具有良好的抗性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段；和S10编码区的205bp；和S4编码区的203bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。本专利技术通过特殊设计并优化，针对RBSDV?S8、S10、S4三个基因共614bp的RNAi靶序列，获得特定的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，克隆并构建到RNAi载体pBDL03中，获得RNA沉默载体pBDL03-S8+S10+S4，然后通过农杆菌转化法转到水稻品种泰粳394中。T1代阳性植株对RBSDV具有良好的抗性。【专利说明】水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列及应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及利用RNAi介导技术构建抗水稻黑条矮缩病毒载体的方法及应用。
技术介绍
水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)隶属呼肠孤病毒(Reoviridae)科斐济病毒(Fi jivirus)属，主要由灰飞風(Laodelphax striatellusfallen)以持久性不经卵方式传播(Milne and Lovisolo, 1977;Azuhata et al.，1993)。该病毒主要引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病，可侵染水稻、大麦、小麦、玉米等禾本科植物。RBSDV于20世纪40年代首先在日本发现，之后在20世纪60年代和90年代在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重的经济损失(徐秋芳等，2012)。近年来，RBSDV危害成逐年加重趋势，造成了严重的经济损失。该病在江苏省2007年的发生面积为2.0 X 104hm2，至2008年迅速上升至2.6X105hm2,2009年则发展到约3.3 X 105hm2 (季英华等，2009)。RBSDV在我国引起了的病害日益严重，给我国的粮食安全带来了严峻的挑战，如何控制并降低RBSDV的危害已是一个极具现实意义的问题。选育和推广抗病品种是防治水稻病毒病最经济、有效的方法，但存在抗性资源缺乏、育种周期长、效率低等问题，因此，充分利用各种分子手段有利于加速水稻抗病育种的进程。随着近年来RN A干扰(RNA interference, RNAi)机制研究的不断深入，利用RNAi的高效性和特异性来控制植物的病毒病已开始得到重视和应用(Cogoni andMacino, 2000)。1998 年 waterhouse 等(Waterhouseet et al., 1998)首次报导了利用 RNAi技术防治马铃薯Y病毒。Shimizu等(Shimizuet et al.，2009)利用RNAi沉默了水稻矮缩病毒(RDV)的pnsl2基因，获得了具有RDV抗性的转基因水稻。因此，采用RNAi技术培育抗病毒植物具有高度可行性。RBSDV含有10条双链RNA(S1_S10)，目前已知RBSDV多个分离物的基因组全序列，而且部分编码蛋白的功能已得到初步验证。如S8编码的蛋白P8为最小的结构蛋白，P8进入寄主并在病毒与寄主互作过程中对寄主基因的表达起负调控的作用(Li et al., 2007)；SlO编码蛋白(63.3kDa)为病毒粒子的外层衣壳蛋白(Liu et al.，2007);S4可编码结构蛋白 B-突起(Zhang et al.，2001)。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，所述基因序列是特定选取了水稻黑条矮缩病毒RBSDV的S8、S10、S4编码区基因序列的组合，设计构建了抗RBSDV的多价RNA沉默载体，通过试验证明了其转化后具有很好的抗病毒活性。本专利技术的技术方案是:一种水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段，对应S8基因30~131bp，1015~1118bp ;和SlO编码区的205bp，对应SlO基因的433~637bp ;和S4编码区的203bp，对应S4基因的2218~2420bp ;在S8的5’端加入BamHl酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。优化后的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列如SEQ ID N0.1所示。本专利技术的RNAi靶序列，可以克隆并构建到RNAi中间载体中，进而获得RNA沉默载体，然后再通过农杆菌转化法转到植物植株中。所述中间载体可以为tENTRA-S8+S10+S4，也可以为其他已知的载体；获得的多价RNA沉默载体为pBDL03-S8+S10+S4。只要含有本专利技术的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列的载体都可以应用于转基因植物的培育中，用于防治水稻黑条矮缩病毒病。植物优选为水稻，也可以为其他同源性高的植物植株。本专利技术通过特殊设计并优化，针对RBSDV S8、S10、S4三个基因共614bp的RNAi靶序列，获得特定的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，克隆并构建到RNAi载体pBDL03中，获得RNA沉默载体pBDL03-S8+S10+S4，然后通过农杆菌转化法转到水稻品种泰粳394中。TI代阳性植株对RBSDV具有良好的抗性。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列图；图2是RNAi表达载体双酶切验证，其中:M:Trans2k plus II ;1:质粒PBDL03-S8+S10+S4 的 KpnI/SacI 双酶切；2:质粒 pBDL03_S8+S10+S4 ；图3是TO代转基因植株的PCR检测，其中M:分子标量Trans2K ;1~7转基因植株；8野生型植株；图4是TO代转基因植株的荧光检测，其中A转基因阳性植株；B野生型植株；图5是Tl代转基因水稻的dot-ELISA检测，其中:A~D行:转基因阴性植株；E~J行:转基因阳性植株(Al，El:健康的泰粳394 ；A2, E2:健康的日本晴；A3，E3:感病的玉米)。【具体实施方式】为进一步说明本专利技术，结合以下实施例具体说明:实施例1三价RNAi基因片段的核苷酸序列与克隆根据NCBI上提交的RBSDV序列，将其在DNAMAN6.0.3.99上进行多序列比对与限制性酶分析，选取相对保守且不含BamHI和XhoI酶切位点的S8、S10、S4编码区基因片段，用武汉晶赛生物工程技术公司的在线设计软件进行siRNA靶位点预测，在水稻基因组数据库(http://signal, salk.edu/cg1-bin/RiceGE)进行脱祀效应预测。优化获得 614bp 的RNAi多价靶基因序列(如图1所示JnSEQ ID N0.1所示)，依次包括S8编码区的206bp片段(对应S8基因30~131bp，1015~1118bp)、S10编码区的205bp (对应SlO基因的433~637bp)、S4编码区的2 03bp (对应S4基因的2218~2420bp)，在S8的5’端加入BamHl酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。将设计好的目的基因序列送上海捷瑞生物工程有限本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，其特征在于：依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段，对应S8基因30～131bp，1015～1118bp；和S10编码区的205bp，对应S10基因的433～637bp；和S4编码区的203bp，对应S4基因的2218～2420bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭立华，邱德文，杨秀芬，曾洪梅，袁京京，赵成金，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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