本发明专利技术公开了一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)PCR检测试剂盒。其包括PCR缓冲液、dNTPs、纯化水和Taq DNA聚合酶及引物，所述的引物碱基序列为SEQ ID No.1~2。本发明专利技术所设计的引物检测特异性好,灵敏度高,非常适用于检测食品中的肠炎沙门氏菌。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种肠炎沙门氏菌(Salmonella?Enteritidis)PCR检测试剂盒。其包括PCR缓冲液、dNTPs、纯化水和Taq?DNA聚合酶及引物，所述的引物碱基序列为SEQ?ID?No.1~2。本专利技术所设计的引物检测特异性好,灵敏度高,非常适用于检测食品中的肠炎沙门氏菌。【专利说明】一种肠炎沙门氏菌的检测试剂盒
本专利技术主要涉及食品质量检测领域，属于微生物检测方法，具体涉及一种沙门氏菌PCR检测引物及检测试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)为肠杆菌科沙门氏菌属,据其抗原结构和生化试验，目前已有2000余种血清型，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌较为多见。该菌为革兰氏阴性杆菌，需氧，不产生芽胞，无荚膜，绝大多数有鞭毛，能运动。对外界的抵抗力较强，在水和土壤中能活数月，粪便中能活I~2个月，在冰冻土壤中能越冬。不耐热，55°C、lh或60°C、10~20分钟死亡，5%石炭酸或1:500升汞5分钟内即可将其杀灭。多种家畜(猪、牛、马、羊)、家禽(鸡、鸭、鹅)、鱼类、飞鸟、鼠类及野生动物的肠腔及内脏中能查到此类细菌。细菌由粪便排出，污染饮水、食物、餐具以及新鲜蛋品、冰蛋、蛋粉等，人进食后造成感染。致病食物以肉、血、内脏及蛋类为主，值得注意的是该类细菌在食品中繁殖后，并不影响食物的色、香、味。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。由沙门氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康问题。在欧洲IS06579:2002和FSISMLG4.04中；检测沙门氏菌是评估产品是否合格的必检项目。在美国，通常是肉，禽，蛋产品中检测出沙门氏菌。 由沙门氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康问题。沙门氏菌是最常见的，新鲜家禽和猪的肉阳性标本的比例，根据欧洲标准(欧盟委员会法规2073/2005)用于评价产品是否符合标准，经分别检测平均为5.5%和1.1%。此外，美国食品安全检验局采用FSIS的方法，检测沙门氏菌。这两个标准的用于检测沙门氏菌培养方法(SCMS)需要长达5天，才能获得结果。这些方法包括预培养，在选择性琼脂上选择性分离，可疑菌落的生化鉴定和血清学确认。该方法是虽然准确，但费力，成本高，费时，且对短保质期的产品无法检测。目前，检测沙门氏菌的方法检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。因此，需要有新的方法能够在一个短的时间内检测，最好能在24小时之内，在一个给定的食物量中检测食品中的病原体。
技术实现思路
本研究的目的是:建立一个新的检测食品中的病原体的方法。为达到直接在食品中肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测的目的。本专利技术提供一种肠炎沙门氏菌的检测试剂盒，采用Primer Express 1.5软件中设计的引物,沙门氏菌PCR检测引物,其为:F:CACCAGGAGATTACAACATGACG SEQ ID N0.1R:CTAGCTCACACCAAAAGTGACCA SEQ ID N0.2。其中，所述的引物扩增片段为ISObp左右的片段，根据电泳结果，即可判断为是否存在病原体基因。本专利技术还提供含有上述引物的沙门氏菌PCR检测试剂盒，所述试剂盒还可包括PCR缓冲液、dNTPs、纯化水和Taq DNA聚合酶等。本专利技术还提供应用上述的试剂盒在食品中检测沙门氏菌的方法，其包括:I)提取食品中的DNA ；2)以步骤I提取的DNA为模板进行PCR扩增；3)对PCR产物进行电泳检测。其中，所述的PCR反应体系为:每20μ I的反应液中，含有(I)引物上、下游各15禮，10(^1;(2)10\?0?缓冲液，1.51111;(3)101111 dNTPs, 1.5ml ； (5) 5U/μ I Taq DNA 聚合BI, 100 μ I ；(4)纯化水，3.0ml。(I)引物上、下游各 15mM,100y I ；(2) 10XPCR 缓冲液(含 Mg2+20mM)，1.5ml ；(3) dNTPs (I`OmM), 1.5ml ；⑷纯化水，3.0ml ; (5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I)，100 μ I。其中，所述的PCR反应条件为:951:预变性11^11，951:变性308，601:退火508，72°C延伸lmin，共35个循环，最后72°C延伸IOmin0取5~10 μ I PCR扩增产物点样于2%琼脂糖凝胶中进行检测，电压为90V，电泳时间为40min，然后观察PCR扩增产物有无180bp左右的特异性片段。本专利技术中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本专利技术不再赘述。本专利技术公开了一种检测食品中肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的引物和试剂盒。本专利技术的检测试剂盒能准确灵敏地检测食品中的沙门氏菌，DNA最低检测浓度为5ng，而且与其他细菌无交叉反应，特异性好，同时样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本低于传统的检测方法，而且本专利技术试剂保存时间长，无污染。本专利技术对解决大批量样品的沙门氏菌的现场检测技术具有重要的现实意义。【专利附图】【附图说明】图1为引物特异性的琼脂糖凝胶电泳分析图。1:DNA Marker ；2:沙门氏菌；3:阴性对照；图2为细菌菌数系列稀释的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析图。1:DNA Marker ；2:阴性对照，5ng梯度稀释的样品、IOng梯度稀释的样品、20ng梯度稀释的样品、40ng梯度稀释的样品、80ng梯度稀释的样品。图3为同时对肠炎沙门氏菌菌株和对照菌株(大肠杆菌、葡萄球菌)进行PCR检测的电泳分析图。1:DNA Marker ;2:肠炎沙门氏菌菌株扩增的结果，3.阴性对照(水)4.葡萄球菌菌株扩增的结果；5.大肠杆菌菌株扩增的结果；【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本文所用到的肠炎沙门氏菌购自中科院微生物所菌种库。实施例1在肉汤培养基中培养肠炎沙门氏菌，37°C培养24小时。4°C以14，OOOrpm离心10分钟，并小心弃去上清液。将沉淀物重新悬浮于200 μ I的PBS中，在56°C下孵育20分钟，然后在100°C下将悬浮液立即在冰上冷却8分钟，以14，OOOrpm离心5分钟，在4°C下，取5 μ L上清液用作PCR的模板DNA。标准计数法检测，菌体为IO81g CFU/mL。提取增菌肉汤的DNA,采用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QiagenBlood&CellCulture DNA Maxi Kit，货号13362)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR缓冲液、dNTPs、纯化水和Taq DNA聚合酶及引物，所述的引物碱基序列为SEQ ID No.1~2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢克焕，
申请(专利权)人：大连德通生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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