纳米模拟酶免疫层析检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测液体样品中的待测物的纳米模拟酶免疫层析检测方法，所述方法依次包括以下步骤：1)提供检测探针，所述检测探针通过将磁性纳米颗粒与能够与所述待测物特异性结合的第一分子偶联制备；2)提供捕获探针，所述捕获探针是固定化的能够与所述待测物特异性结合的第二分子；3)使所述液体样品与所述检测探针接触；4)使与所述检测探针接触过的所述液体样品与所述捕获探针接触；以及5)向经过步骤4)的所述捕获探针加入供氢底物和过氧化物进行显色反应。本发明专利技术还提供一种用于检测液体样品中的待测物的纳米模拟酶免疫层析检测装置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米材料及生物医学纳米
本专利技术涉及磁性纳米颗粒模拟酶，并提供了其应用于免疫层析生物分子检测的方法。
技术介绍
胶体金免疫层析法是20世纪90年代初发展起来的以胶体金为标记物的检测方法，它把免疫亲和技术、印渍技术和斑点薄层层析技术组合在一起。由于用该层析条检测的时候，所有样品均经过较窄的纤维素膜的持续性反应，实际上对被测物质起到了浓缩、聚集作用，提高了反应的灵敏度，加快了反应速度，整个操作时间仅需3～15分钟。其原理是将特异的抗体(或抗原)先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动(层析)，当移动至固定有抗体、抗原的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金作标记物可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。传统的胶体金免疫层析技术具有操作简便、经济、快速等特点，但由于灵敏度相对较低，严重制约了其在生物分子检测方面的广泛应用，信号放大是解决免疫层析技术灵敏度低的关键所在。磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性，其既具有纳米材料所特有的性质，如粒径小、比表面积大、偶联容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热，利用这些特性，磁性纳米颗粒被广泛应用于磁共振对比剂、磁靶向药物载体、细胞与生物分子分离、生物传感与检测以及磁感应肿瘤热疗等生物学领域。<br>最近几年，磁性免疫层析(Magnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)作为一种新一代单人份快速定量检测技术逐渐发展起来，它是以超顺磁性纳米颗粒代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，最后通过磁信号阅读仪读取结合在检测线处磁颗粒的磁场强度，从而对所检样品进行定性定量判断。目前国内成型的磁信号阅读仪还没有上市，国际上也只有少数外国公司(如美国MagnaBioSciences公司)具有该项技术，但其价格昂贵，因而限制了磁性免疫层析的发展和推广。近年来，我们课题组研究发现磁纳米颗粒具有内在的模拟酶活性，可替代过氧化物酶进行免疫检测(阎锡蕴等，Nature Nanotechnology.2007)。最近，我们课题组又研制了三功能(识别、催化、磁性)于一体的新型免疫组化检测试剂，发现磁颗粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(阎锡蕴等，Nature Nanotechnology.2012)。这种催化活性与辣根过氧化物酶相似，在过氧化氢存在下，磁性纳米颗粒可以催化辣根过氧化物酶的底物，如可以催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的产物，催化二氨基联苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化邻苯二胺(OPD)生成橘红色产物，催化活性依赖于pH值、温度和过氧化氢浓度，其催化机理符合乒乓机制。同时还发现磁性纳米颗粒的催化活性随着颗粒粒径的减小而增强，颗粒的粒径越小，其催化活性越高。磁性颗粒的粒径达微米量级后，催化活性降低至接近零值。磁性纳米颗粒的模拟酶活性，相比蛋白制剂的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)，具有更多的优势：(1)蛋白酶在极端pH和温度下容易变性，同时也容易被蛋白酶降解，而磁性纳米颗粒在极端条件下很稳定；(2)蛋白酶的生产成本很高，而磁性纳米颗粒制备简单、廉价；(3)由于磁性纳米颗粒具有超顺磁性，用磁铁可以回收反复利用；同时基于磁性纳米颗粒的磁可控性，拓展了其作为模拟酶的应用领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有免疫层析技术存在的不足，提供一种纳米模拟酶免疫层析检测方法，其基本原理同胶体金试纸条，首先将某一特定抗原特异的抗体A与磁性纳米颗粒偶联，制备磁颗粒垫，然后将另一种针对此抗原的抗体B固定于硝酸纤维素膜的特定区带形成检测线(T线)，将抗抗体A的抗体(二抗)也固定于硝酸纤维素膜的特定区带形成质控线(C线)，与T线平行，组装和制备磁性免疫层析试纸。当干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至磁颗粒垫时，磁颗粒上的抗体A就会与抗原反应，生成抗原-抗体A-磁颗粒的复合物，继续经毛细管作用移动到固定有另一抗体B的T线区域时，样品中的抗原就会与这一抗体B发生反应，最后生成抗体B-抗原-抗体A-磁颗粒复合物；而没有结合抗原的磁颗粒抗体探针继续向前移动，在C线处与二抗结合形成二抗-抗体A-磁颗粒复合物，磁颗粒就会在T线和C线处聚集。如果样品中的抗原浓度较高，那么在T线处聚集的磁颗粒也多，会显示出磁颗粒的颜色；如果样品中的抗原浓度很低时，则T线处聚集的磁颗粒很少，不足以显示出磁颗粒的颜色，这时加入过氧化物和供氢底物如TMB、DAB等，利用磁颗粒的过氧化物酶催化作用产生大量沉淀而增强强检测信号，以检测出低浓度的抗原物质。该技术集磁性纳米颗粒过氧化物酶催化活性及磁分离特性于一体，层析后通过加入过氧化物和供氢底物如邻苯二胺(DAB)等，利用磁颗粒的酶催化作用产生棕色沉淀，从而增强检测信号，提高灵敏度，使得检测结果通过肉眼观察即可以判定，免除了对仪器的依赖性，基于此新技术的生物样本检测，简便快速、非常适合现场使用。本专利技术通过以下技术方案来实现：纳米模拟酶免疫层析检测方法，所述方法包括：1)采用合适尺寸的磁性纳米颗粒，将特异性结合待测抗原的生物分子偶联于其表面制备特异性纳米颗粒探针，制备出磁颗粒垫；2)组装和制备磁性免疫层析试纸；3)层析反应，待检抗原与磁纳米探针、检测线抗体、质控线抗体反应形成夹心复合物，阳性样品会在T线处形成磁颗粒聚集；4)显色反应，加入过氧化物和供氢底物如TMB、DAB等，利用磁颗粒的酶催化作用产生大量沉淀而增强检测信号；5)根据实验结果，实现对靶标分子的定性和半定量检测。进一步地，本专利技术提供纳米模拟酶免疫层析检测方法，其中所述组装和制备磁性免疫层析试纸条是将包被膜、结合了待检抗原所对应抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫以相互交错的形式依次粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有待检抗原的检测线和质控线。更进一步地，上述的纳米模拟酶免疫层析检测方法，其特征在于：所述磁性纳米颗粒可以是球形、棒形、立方形、三角形、多角形等形状的任意一种；其粒径在10纳米至500纳米范围内；其可以是裸露的磁颗粒、也可以是蛋白外壳如病毒外壳、转铁蛋白外壳、铁蛋白外壳包被的磁颗粒；其可以是F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测液体样品中的待测物的纳米模拟酶免疫层析检测方
法，所述方法依次包括以下步骤：
1)提供检测探针，所述检测探针通过将磁性纳米颗粒与能够与所述待
测物特异性结合的第一分子偶联制备；
2)提供捕获探针，所述捕获探针是固定化的能够与所述待测物特异性
结合的第二分子；
3)使所述液体样品与所述检测探针接触；
4)使与所述检测探针接触过的所述液体样品与所述捕获探针接触；以
及
5)向经过步骤4)的所述捕获探针中加入供氢底物和过氧化物进行显
色反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性纳米颗粒的粒径在10
纳米至500纳米范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性纳米颗粒是Fe3O4磁性
纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述待测物是蛋白质、多肽或核
酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述待测物是蛋白质，并且所述
第一分子和所述第二分子是针对所述蛋白质的特异性抗体，优选是单克隆
抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一分子与所述磁性纳米颗
粒通过EDC-NHS法偶联。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述供氢底物包括四甲基联苯胺
(TMB)、四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺
(DAB)、二氨基联苯胺四盐酸(DAB-4HCl)、5-氨基水杨酸(5-AS)、邻联甲
苯胺(OT)或连氮二铵盐(ABTS)。
8.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，段德民，张德玺，杨东玲，冯静，宋丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：